FAT10在膠質瘤發生發展和放療抵抗中的可能作用機制

劉 輝，閔 彬，涂艷陽

（1第四軍醫大學唐都醫院實驗外科，陜西 西安710038；2空軍工程大學門診部，陜西西安710051）

0 引言

惡性膠質瘤（malignant glioma）是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，是最常見的顱內原發性腫瘤，具有較強的復發性及侵襲性，臨床上治愈率極低，且預后較差。因其多呈浸潤性生長，外科手術很難達到真正的全切除，因此常于術后輔以放、化療，以提高膠質瘤患者的綜合治療效果。放射治療是有效的并被廣泛采用的治療惡性膠質瘤的方法之一，但許多臨床資料卻顯示，放療對膠質瘤的總體療效不盡人意，治療效果存在極大的個體差異，大多數使用高劑量放療后的膠質瘤依舊復發，或者在加大照射劑量后，放療在殺滅膠質瘤細胞的同時，也會造成周圍甚至全身的正常組織或器官的損傷，從而提示我們，膠質瘤有較強的放療抵抗性。因此，尋找膠質瘤發生發展和放療抵抗調控中的關鍵信號途徑和核心調控分子是對膠質瘤細胞進行分子干預的前提，對膠質瘤的臨床治療具有重要的意義。

FAT10也稱為雙泛素，屬于泛素樣調節子（ubiq?uitin?like protein，UBL）蛋白家族，在許多腫瘤組織中高水平表達，如卵巢癌、結直腸癌、肝癌等，與腫瘤的發生、發展、轉移等生物學過程密切相關。研究［1］表明，FAT10會引起人結直腸癌細胞的紡錘體聚集檢測點蛋白（mitotic arrest defect 2，MAD2）的功能異常而導致染色體不穩定，從而發生癌變。另外，研究［2］還發現FAT10可以受到抑癌基因p53的負調控，且通過參與細胞周期調節在腫瘤的發生發展中發揮作用。膠質瘤的發病原因同其他腫瘤一樣，都是多基因、多事件積累的結果。研究細胞轉導通路在膠質瘤中的過度表達或關閉已成為探索膠質瘤病因、發展、放化療抵抗、預后的一種重要方法。許多研究［3－5］結果表明，PI3K／AKT信號通路可以調節腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡、分化等特性，進而在腫瘤發生的過程中起重要作用，而這種調控活性在人腦膠質瘤的發生發展過程中同樣發揮作用。GSK3β作為PI3K／Akt信號傳導通路的下游蛋白，可受pAkt的抑制，從而降低了細胞周期素CyclinD1的降解。這一過程也是膠質瘤在放療抵抗過程中的重要因素之一。

FAT10基因在肝癌的發生發展中發揮著重要作用，并且其功能是通過PI3K／Akt／GSK3β通路來實現的，而 PI3K／Akt／GSK3β／CyclinD1 通路在腫瘤放療抵抗中又起到至關重要的作用。那么FAT10／PI3K／Akt／GSK3β／CyclinD1通路是否會影響膠質瘤發生、發展以及放療抵抗，其具體的分子機制又是怎樣的？因此，本文旨在探討 FAT10通過調控 PI3K／Akt／GSK3β／CyclinD1通路影響膠質瘤發生發展和放療抵抗的可能分子機制，闡明 FAT10是否對 PI3K／Akt／GSK3β／CyclinD1通路具有調節作用，并從G1／S期轉變、DNA損傷反應和DNA雙鏈斷裂三個方面探索膠質瘤放療抵抗的分子機制，從而揭示影響膠質瘤發生發展以及放療抵抗的新的分子機制，為針對膠質瘤的治療提供新的潛在靶點，為膠質瘤的分子治療策略提供實驗和理論依據.

1 膠質瘤

膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，占顱內腫瘤的50%～60%。其不僅增殖能力較強，易形成大塊腫物，而且還具有很強的侵襲特性，能與正常腦組織混合生長，因而用手術無法將瘤組織全部清除。即使輔以放、化療，膠質瘤的治療效果仍然較差。據統計，膠質瘤治療后，患者平均五年存活率為20%～30%，而膠質母細胞瘤五年存活率僅為1%［6］。因此，尋找和發現膠質瘤發生發展及放療抵抗調控中的關鍵信號途徑和核心調控分子是對膠質瘤細胞進行分子干預的前提，對膠質瘤的臨床治療具有

重要的意義。

2 FAT10的研究進展

2.1 FAT10簡介FAT10蛋白大小 18 kDa，由 165個氨基酸組成，屬于UBL家族，由兩個泛素樣部分融合而成，在每個組成部分中有保守的賴氨酸殘基，是共價結合底物蛋白并形成多泛素的位點［7－9］。泛素?蛋白酶體主要負責降解細胞內的蛋白，它可根據代謝和功能的需要降解轉錄因子、關鍵酶以及細胞周期調控蛋白等。FAT10可通過其羧基末端2個甘氨酸共價結合靶蛋白而發揮泛素樣修飾作用，且其可以更快速但不可逆地進行降解過程，而FAT10在這一過程中也同時被降解。在這個過程中，NUB1L（neg?ative regulatorof ubiquitin?like proteins 1）蛋白通過與FAT10非共價相互作用發揮重要作用［10］。泛素?蛋白酶體系統不僅具有降解蛋白的功能，還與很多生物學過程密切相關，如細胞分裂、DNA修復、自唆、信號轉導及胚胎發育等過程［11］，而且其對許多腫瘤，包括膠質瘤的發生發展也產生了重要影響。

2.2 FAT10在膠質瘤及其它一些腫瘤中的作用及其機制研究［12］表明，FAT10在多種腫瘤組織中高水平表達，如卵巢癌、結直腸癌、肝癌、宮頸癌等，與這些腫瘤的生物學過程密切相關。那么FAT10在腫瘤中的高表達水平的機制又是什么呢？迄今為止，FAT10的機制研究主要集中在其調節人紡錘體聚集檢測點蛋白的功能方面，這個蛋白主要發揮保持有絲分裂時紡錘體完整性的作用。有研究［13］報道，FAT10的過表達可以導致人結直腸癌細胞HCT116的MAD2蛋白功能異常，使細胞有絲分裂時不發生分離而出現異常分裂，最終引起染色體的不穩定 （chromosomal in?stability，CIN），從而發生癌變。此外，FAT10能參與調節細胞周期，其過表達可縮短細胞的有絲分裂期，使許多細胞能逃避有絲分裂期的控制而導致染色體的不穩定。 此外，有研究［14－15］還報道 FAT10的表達可受到p53的負調控，野生型的p53與FAT10啟動子區結合并抑制FAT10的表達，而突變型p53則無此功能。Liu等［16］報道了FAT10在肝癌中的一些重要作用：FAT10在肝癌細胞中可激活Akt／Gsk3β信號通路，并與細胞的增殖、侵襲及EMT密切相關，FAT10還可上調G1／S周期相關蛋白表達水平，促進細胞周期進展，進而促進肝癌發生及惡性進展。而研究者通過篩選與肝癌發生發展過程相關的一系列可能影響FAT10生物學功能的信號通路，主要包括STAT、PI3K／AKT、p38、ERK、NF?κB 及 JNK 等信號通路，最終通過運用通路抑制劑發現，FAT10可能通過激活AKT／Gsk3β信號通路從而參與調控肝癌的一系列生物功能。具體如下：FAT10激活AKT／Gsk3β信號通路后可上調 β?catenin的表達及胞核轉位，β?catenin入核后可以調控與細胞增殖和細胞周期相關的蛋白，如CyclinD1、c?myc等，同時其還可以通過促進 vimentin表達和抑制 E?cadherin表達而誘導EMT發生。此外，FAT10還可通過激活AKT／GSK3β信號通路來調控 E?cadherin的上游調節蛋白，如snaill和 smad2／3 等的表達，最終導致 E?cadherin 的表達降低和 EMT發生［17－18］。 目前關于 FAT10在膠質瘤中作用的研究極少，而我們前期在膠質瘤患者樣本中的實驗結果表明，FAT10在膠質瘤中高表達，并且隨著膠質瘤病理等級的升高表達也逐漸上升，與膠質瘤患者總體生存率及術后復發有密切的關系，并能作為獨立判定膠質瘤患者預后的因素。因此，FAT10在膠質瘤中也像在其它一些腫瘤中一樣，對膠質瘤的發生發展起著重要的作用。而其調節膠質瘤發生發展的分子機制又是什么呢？也是通過 PI3K／Akt／GSK3β信號通路？這還需在以后的研究中做進一步的證實。

3 PI3K／Akt／GSK3β 信號通路在膠質瘤中的作用

人腦膠質瘤是神經系統腫瘤中最常見的類型，占顱內腫瘤的50%～60%，不同級別的膠質瘤之間，甚至相同級別不同個體之間的預后差別甚大，這就需要我們更加深入地了解膠質瘤發生發展及其惡化過程，洞悉其產生的細胞信號傳導通路，從而為治療膠質瘤提供新的理論依據及尋找新的靶點。PI3K／AKT信號通路在人類多種腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用：PI3K／AKT信號通路提高腫瘤細胞的生存和增殖能力，其是通過抑制細胞調亡，促進細胞周期進展而實現的。同時PI3K／AKT信號通路還可參與腫瘤的血管形成，參與腫瘤的侵襲和轉移，在腫瘤的發生發展中扮演重要角色［19］。在提高腫瘤細胞的增殖能力方面，PI3K可通過AKT／mTOR通路將有絲分裂信號傳遞給P70S6K，進而使細胞周期素（cyclin）的表達上調，并進一步促進 G1期進展，使細胞周期加速［20－21］。 而在抑制腫瘤細胞凋亡方面，Akt是通過調控多個與細胞凋亡相關的家族蛋白來實現的。PI3K／Akt信號通路激活后，前凋亡蛋白 BAD及caspase9的活性因被磷酸化而受到抑制，且細胞色素c的釋放也同樣受到了抑制，繼而線粒體能保持完整，從而細胞凋亡受到抑制［22－24］。 在促進腫瘤侵襲方面，PI3K／Akt通路激活后，基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）在 mRNA 和蛋白質水平都發生了顯著的上調，進而誘導刺激了癌細胞的侵襲。而PI3K／Akt／GSK3β信號通路在人腦膠質瘤的發生發展過程中是否也起到同樣的作用？下面，我們就PI3K／Akt／GSK3β信號傳導通路中的關鍵分子或者蛋白的生物學結構及生物學功能進行分析。

PI3K，磷脂酞肌醇3?激酶，是一類特異性磷酸化肌醇磷脂3位羥基的激酶，稱為PI3Ks家族，同多種癌基因如v?src和v?ras等的產物密切相關。其活化可以通過接受如PDGF、IGF、bFGF等生長因子刺激或著通過Ras同p110直接結合。一般來說，PI3K可以通過兩種方式激活：第一是二聚體構象改變而被激活，這是PI3K通過與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體或者連接蛋白相互作用來實現的；第二，PI3K可通過與 p110、Ras直接結合而活化［25］。 在PI3K被激活后，質膜上會產生PIP2和PIP3等第二信使，并同細胞內其它含有PH結構域的信號蛋白Akt和 PDK1（phosphoinositide?dependent kinase?1）結合，從而促使 Akt的活化。 Bad、Caspase9、NF?κB、GSK3等均為活化后Akt的下游靶蛋白，活化后的Akt即pAkt通過磷酸化作用激活或者抑制這些靶蛋白，進一步調節細胞的增殖、遷移、凋亡和分化。

在PI3K／AKT信號通路中，Akt是關鍵蛋白，處于通路的中心環節，同PKA、PKC相關的蛋白激酶因高度同源，一起被稱為PKB（protein kinase B）。在膠質瘤的發生過程中，Akt功能的活化也是其中一個重要的不可忽視的因素：pAkt主要作用于PI3K／Akt抗凋亡通路，激活后的Akt通過磷酸化其下游的靶蛋白，如GSK3β蛋白等，發揮抗凋亡的作用。除此之外，Akt還能通過很多途徑影響細胞的生長與凋亡：首先，其可直接作用于細胞周期，通過傳遞生存信號以抑制細胞的凋亡；其次，pAkt還能通過對p53和NF?κB的間接作用而影響細胞存活；再次，pAkt還能通過磷酸化作用于轉錄因子Forkhead家族的成員FKHR，通過抑制FKHR的基因靶點——FAS和BIM配體的激活，以及FKHR的核轉位而抑制凋亡；同時，pAkt能通過磷酸化蛋白水解酶Caspase?9和Bcl?2家族成員BAD來抑制細胞的凋亡；最后，pAkt可以升高CyclinD的mRNA和蛋白水平，推動細胞周期的進行，而且這種上調作用無需生長因子的維持。Akt的這些功能都暗示著其與膠質瘤的發生發展及放療抵抗之間可能存在著密切聯系，其可能在FAT10作用膠質瘤的過程中發揮關鍵作用。

多數文獻也肯定了pAkt在PI3K／Akt信號傳導通路中的關鍵作用，甚至有報道，在膠質瘤的預后中，pAkt的含量是僅次于手術切除率的第二大影響因素［26］。但是有關Akt作為膠質瘤治療靶點的問題則存在一定的爭議。有文獻［27］報道，在惡性程度高的膠質瘤中，pAkt抑制劑可以抑制腫瘤的發展，而Akt的抑制劑則沒有這種作用。但另有報道［28］指出，在膠質母細胞瘤中，Akt及pAkt的表達均有一定程度的提高，并肯定了兩者在惡性膠質瘤中的靶向治療效果。

綜上所述，pAkt是Akt的活性形式，用以體現其生物學功能，在調控細胞周期，影響細胞的侵襲性和凋亡、血管生成和端粒酶活性等諸多方面發揮作用（圖1）。總體來講，pAkt可以促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，所以pAkt在正常腦組織中是低表達（相對于膠質瘤）的，而在膠質瘤細胞中表達量升高，并與正常腦組織中的表達量差異顯著。所以，pAkt在膠質瘤的發生發展及放療抵抗中可能有著十分重要的作用。

圖1 Akt可能參與的信號通路對細胞的調節作用

在PIK3／Akt信號轉導通路中，GSK3是pAkt的下游靶蛋白，有關GSK3的功能研究是最近的研究熱點。GSK3本身有抑制凋亡，促進生長的作用。那么在PI3K／AKT信號傳導通路中，它又是以怎樣的形式參與，發揮怎樣的生物學作用呢？

近年來，有關GSK3功能的研究逐漸成為腫瘤研究中的熱點，研究［29］證明，GSK3作為一種多功能激酶，在細胞增殖、細胞運動、細胞分化、蛋白合成、腫瘤發生發展等方而都扮演了重要角色，在多種腫瘤組織中均高表達。GSK3在哺乳動物中包括兩個亞基，即GSK3α和GSK3β。GSK3β活性調節異常與人類多種疾病如糖尿病、腫瘤、神經退行性疾病、情感障礙和炎癥等密切相關，已經證明在腫瘤形成中GSK3β發揮了重要作用，目前至少發現 Wnt、NF?κB和 PI3K／Akt三條與腫瘤密切相關的轉導通路與GSK3β聯系密切［30－31］。 已有實驗［32］證實，GSK3β 蛋白在正常腦組織和膠質瘤中均有表達，主要位于細胞質中，為棕黃色細顆粒狀，在正常腦組織中呈高表達，在膠質瘤組織中相對低表達（P＜0.01）；將 41例膠質瘤分成WHOⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級，GSK3β的表達水平隨著腫瘤級別升高而逐漸降低，各組均存在顯著性差異（P＜0.01）；GSK3β在膠質瘤組織中的表達與患者的性別、年齡無關；且在正常腦組織中高表達；隨著膠質瘤惡性程度的增加，表達水平在逐漸降低，該結果提示GSK3β可能具有抑癌作用，增加GSK3β活性可減少膠質瘤細胞的增殖，GSK3β有望成為治療膠質瘤的一個新靶點。這些都提示我們，GSK3β也可能是FAT10通過PI3K／Akt／GSK3β信號通路調控膠質瘤過程中的一個重要靶蛋白，證實這一作用也是我們要解決的關鍵問題。

4 細胞周期素在膠質瘤放療抵抗中的作用

腫瘤的放療敏感性是多基因參與、多步驟、多階段的調控結果。細胞周期在放療后發生的最主要的變化是G1／S期的延遲和G2／M期的阻滯。而細胞在細胞周期的各階段對放射的敏感性差異很大，G0期對放射抗拒，S期不敏感，G1期次之，最敏感的是G2期。腫瘤發生中最常改變的共同通路是以Cyc?lins／CDKs／CKI／pRb 為核心的 G1／S 期細胞周期網絡調控系統［33－34］。關于細胞周期調控機制的研究結果表明，促進細胞增殖、啟動細胞周期的主要的調控點在G1期，細胞在外界生長因子的刺激下一旦越過G1／S期這個限制點，細胞周期的推進就變得不可逆轉，即自動很快完成分裂過程而不再受外界信息刺激的調控［35］。

作為PI3K／Akt／GSK3β通路下游的一個與細胞放療抵抗密切相關的蛋白，細胞周期素CyclinD1，對細胞周期的G1期調控發揮重要的作用。它可以與Cdk4結合，介導Rb的磷酸化以釋放E2F轉錄因子，使其不再抑制細胞的生長而促使細胞進入S期，是細胞周期中期向S期轉化的重要調節因子，也是G1／S期行進的控制點，對于細胞周期的行進必不可少。過表達CyclinD1可以促使CVS期轉換時間縮短，且引發細胞G1／S期調控檢測點失調，進而加速細胞周期的進程，引發細胞不可逆的異常增殖，從而致使細胞增殖和凋亡的紊亂失控。CyclinD1在細胞周期調控因子中與細胞增殖的關系最為密切［36］，通過相應的細胞周期素依賴性蛋白激酶（cyclin dependent kina?ses，CDK）在細胞的分裂增殖中發揮著重要的生物學作用，它還是調節細胞周期行進的重要正性調節因子，參與細胞周期調控，在某種程度上反映細胞的增殖活性和放療抵抗性，是連接外界生長因子、信號傳導與細胞周期調控機制的紐帶，被認為是一種在分子醫學研究中非常有用的生物學指標［37－38］。而膠質瘤的放療抵抗是否也與CyclinD1的過表達密切相關？FAT10 是否通過 PI3K／Akt／GSK3β 信號通路調控CyclinD1的表達而進一步調控膠質瘤的放療抵抗性？還都需要實驗進一步證實。

5 結語

在人腦膠質瘤中，FAT10基因可能是一個重要的癌基因，其在膠質瘤中高表達，可能與膠質瘤的發生、發展有著密切的聯系。而其可通過直接引起PI3K／Akt／GSK3β／CyclinD1信號通路的激活使膠質瘤產生放療抵抗。而PI3K／Akt信號傳導通路是公認的與細胞增殖、分化、凋亡等的調節有密切關系的信號傳導通路之一，在人腦膠質瘤中可以觀察到此信號傳導通路的過度激活及表達，這種過度激活可以通過其關鍵蛋白的表達量來體現。在此信號傳導通路中，關鍵蛋白為Akt，Akt磷酸化后可成為其活性形式pAkt，從而體現其生物功能，發揮抑制凋亡，促進生長的作用。其在正常腦組織中是低表達的，而在膠質瘤細胞中表達量升高，并與正常腦組織中的表達量差異顯著。另外，在PI3K／Akt信號傳導通路的下游，pAkt的一個靶蛋白，GSK3β也是目前研究的熱點。GSK3β主要參與信號傳導通路，可以抑制細胞蛋白合成的過程，或者通過調節轉錄因子促進凋亡，是一種決定細胞命運的關鍵物質。與Akt不同的是，GSK3β是為數不多的通過磷酸化而失活的蛋白激酶之一，PI3K／Akt信號傳導通路中的Akt、PKA、PKC等激酶均可以通過磷酸化Ser9來抑制GSK3β的活性。也就是說，GSK3β本身可以促進細胞的凋亡，但若 Akt通過Ser9位置的磷酸化GSK3β成為pGSK3β后，GSK3β的活性是下降的，故pGSK3β增多可以抑制細胞的凋亡，也可以說是參與了腫瘤的發生、發展過程。

另有研究［39］表明，腫瘤細胞放療抵抗性的獲得是通過改變DNA損傷反應（DNA damage response，DDR）或者加強腫瘤細胞的DNA損傷修復來實現的。在放療后，一系列的DDR開始發揮作用，且細胞周期檢驗點也被激活來阻止細胞進行DNA損傷修復的過程。G1／S檢驗點通過抑制細胞周期素依賴性蛋白酶來啟動，其與 CDKs結合來調控細胞周期，比如，CyclinD1可以與Cdk4結合，結合后的復合物通過激活Rb，繼而釋放E2F來調控G1／S轉變進程。當細胞受到發射刺激，產生DNA損傷時，PI3K介導Akt轉位至細胞質膜并激活Akt，激活的Akt又可通過抑制GSK3β來減少Cyclin D1的降解，而CyclinD1的過表達又進一步加劇了DNA損傷程度，形成了一個CyclinD1過表達與放療抵抗之間的反饋調節（圖2）。

圖 2 FAT10／PI3K／Akt／GSK3β／CyclinD1 通路在放療抵抗中可能作用機制

我們前期的研究結果已表明，在膠質瘤中，FAT10高表達，且在體內外對膠質瘤的發生發展起著至關重要的作用，而 PI3K／Akt／GSK3β／CyclinD1 通路也是膠質瘤中重要的一條信號通路，這兩者之間是否存在著緊密聯系？FAT10是否是通過這條信號通路在膠質瘤發生發展甚至放療抵抗中發揮作用？其調節這條信號通路的機制是什么？在膠質瘤產生放療抵抗時，是否也存在一個DNA損傷與FAT10高表達之間的反饋調節？這些都還是需要研究者證實的問題。

本文旨在探討 FAT10通過調控 PI3K／Akt／GSK3β／CyclinD1通路影響膠質瘤發生、發展及放療抵抗的分子機制，以期揭示影響膠質瘤發生的新的分子機制，為針對膠質瘤的治療提供新的潛在靶點，為膠質瘤的分子治療策略提供實驗和理論依據。

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