含PBMC自體PRP在四肢軟組織非急性感染創面中的臨床應用研究

胡爭波，李文虎，袁艾東，張浩波，藍文興，賴勇斌，伍鵬歡，陳 錚

［南方醫科大學附屬韶關醫院骨科（韶關市第一人民醫院骨科），廣東韶關512000］

0 引言

四肢軟組織感染創面，尤其是亞急性、慢性感染創面一直是臨床治療的棘手問題［1－2］。在三甲醫院幾乎都專門開設創面治療中心來處理這一類患者。傳統的治療方法是多方面的，包括分泌物培養加藥敏試驗指導針對性抗生素治療，創面清創手術、創面負壓吸引、傷口換藥和中醫藥治療等［3－7］。 總體上，非急性感染創面的傳統治療往往需要長時間住院和門診換藥，但治療效果依舊不理想，嚴重影響了患者的生活質量，也給社會和家庭帶來了沉重負擔。因此，臨床醫護人員也在不停探索新的治療方法或輔助治療方法。隨著PRP在骨科臨床上的應用，富血小板血漿（platelet?rich plasma，PRP）對骨與軟組織病損具有很強的修復作用［8－9］，而且既往研究還發現含白細胞的 PRP具有抗菌、降低感染率的作用［10－11］。 另外，血液單核細胞來源于骨髓，是尚未成熟的骨髓基質干細胞，不僅具有干細胞潛能，也因內含非異性酯酶而具有很強的吞噬作用［12－13］。 因此，臨床上專門針對非急性感染性創面，制備含單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PMBC）自體 PRP，與傳統治療方法結合應用?，F將其與單純自體PRP和傳統治療病例進行回顧性對比分析，評價其治療作用和臨床應用價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料收集2015年4月～2017年10月收治的四肢非急性感染性創面病例進行回顧性分析（表 1）。

1.2 病例入選標準住院病例為創傷后感染且病程超過1個月，創面分泌物細菌培養陽性，血培養陰性，有炎癥指標（白細胞計數、血沉、超敏C反應蛋白和降鈣素原等）檢查和復查的病例。

1.3 病例排除標準患有腫瘤、血小板功能異常、嚴重貧血、精神病、血液病、纖維蛋白合成障礙、嚴重心肺功能不全、嚴重肝腎功能不全、服用免疫抑制劑、感染急性期、骨髓炎的病例。

1.4 治療方案與分組非PRP治療組：通過單純傳統治療方法如分泌物培養加藥敏試驗指導針對性抗生素治療，創面清創手術、創面負壓吸引、傷口換藥和中醫藥治療等。自體PRP治療組：在傳統治療的基礎上，應用自體PRP治療。含PBMC自體PRP治療組：在傳統治療的基礎上，應用含PBMC自體PRP治療。

1.5 自體PRP和含PBMC自體PRP的制備方法

自體PRP和含PBMC自體PRP由冠昊生物科技股份有限公司專業技術人員按照Aghaloo兩次離心法制備［14］，所有操作均為兩人配合，一人操作，一人輔助在同一實驗利用相同的儀器設備完成。每27 mL靜脈血加入3 mL枸櫞酸鈉抗凝劑制備3 mL自體PRP或含PBMC自體PRP注射劑或凝膠。

1.6 觀察指標通過觀察患者治療前、后首次復查的炎癥指標包括白細胞計數（WBC）、全血紅細胞沉降率（ESR）、超敏 C 反應蛋白（hs?CRP）、降鈣素原（PCT）、白／球蛋白比（A／G），以及病原體構成、抗生素使用種類和時間、住院時間、住院總費用、創面愈合時間和創面臨床愈合出院率等指標分析評價含PB?MC自體PRP在四肢軟組織感染創面中的臨床效果和價值。創面臨床愈合標準定義為創面面積縮小＞75%，且連續3次創面分泌物培養陰性。隨訪至創面達到臨床愈合標準。

1.7 統計學處理采用SPSS19.0軟件進行數據分析，計量資料中，三組比較用單因素方差分析，兩組數據比較使用t檢驗，計數資料用卡方檢驗，取P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況比較三個病例組在性別、年齡、體重指數、疼痛評分等方面差異無統計學意義（表1）。其病原體均為耐藥菌屬，G＋／G?構成比差異無統計學意義（圖 1）。

表1 各治療組一般資料比較情況

圖1 非PRP治療組、自體PRP治療組和含PBMC自體PRP治療組病原體構成

2.2 治療效果與應用價值評價三組病例在治療前各炎癥指標無明顯差異（表2，圖2A～E），而在治療后首次復查時，WBC（圖2A）和ESR（圖2B）差異無統計學意義（FWBC＝ 0.01005，PWBC＝ 0.9900；FESR＝0.4578，PESR＝0.9553）；hs?CRP（圖 2C）、PCT（圖 2D）和A／G（圖 E）有明顯改善，差異有統計學意義（Fhs?CRP＝ 15.17，Phs?CRP＜ 0.001； FPCT＝ 7.676，PPCT＝0.009；FA／G＝ 6.087，PA／G＝ 0.0034）；含 PBMC 自體PRP組較非PRP組、自體PRP組改善更明顯，差異有統計學意義（P＜0.05，表 2）。

表2 各組病例治療前、后首次復查的炎癥指標比較

圖2 非PRP治療組、自體PRP治療組和含PBMC自體PRP治療組在治療前和治療后首次復查時的炎癥指標比較

在創面愈合時間上，非PRP組、自體PRP組和含PBMC 自體 PRP 組愈合時間分別為（38.0±30.8）d、（36.1±25.0）d、（28.7±17.2）d，后兩組創面愈合時間短，但差異無統計學意義（圖 3A，F＝1.038，P＝0.3588）。 三組的抗生素使用種類依次分別為（3.36±1.1）、（3.34±0.9）、（3.19±1.04），差異無統計學意義（圖 3B，F＝0.2289，P＝0.7959）；其抗生素使用時間分別為（21.2±6.7）d、（18.3±6.5）d、（15.9±6.4）d，差異有統計學意義（圖 3C，F＝4.835，P＝0.0103）。 三組手術次數依次為（3.09±1.18）、（2.79±1.01）、（2.74±1.02），后兩組手術次數相對較少，但差異無統計學意義（圖3D，F＝0.9353，P＝0.3965）。 三組的平均住院時間分別為（49.7±18.8）d、（41.7±18.4）d、（32.3±12.9）d，差異有統計學意義（圖 3E，F＝7.517，P＝0.001）。 三組的創面愈合出院率分別為 66.67%（22／33）、78.57%（22／28）、80.77%（21／26），自體 PRP 組和含 PBMC自體PRP組較高，但差異無統計學意義（圖3F，F＝1.8562，P ＝ 0.3953）。 三組患者住院總費用依次為（4.63±1.56）萬元、（4.20±1.60）萬元、（3.57±0.77）萬元，自體PRP組和含PBMC自體PRP組較少，差異有統計學意義（圖 3G，F＝4.248，P＝0.0175）。 三組病例均未出現感染擴散、敗血癥、創面惡化等情況。

圖3 非PRP治療組、自體PRP治療組和含PBMC自體PRP治療組在臨床應用價值方面的比較

2.3 含PBMC自體PRP治療非急性感染性創面的典型病例例1：女性患者，88歲，車禍傷后致使右側下肢多處軟組織挫裂傷病壞死感染。創面經含PB?MC自體PRP治療后2次，第2次治療2周后創面完全愈合（圖4）。

圖4 含PBMC自體PRP治療非急性感染創面典型病例1

例2：男性患者，36歲，因玻璃墜落割傷右側跟腱斷裂，后發生創面感染，經過含PBMC自體PRP注射治療1次，2周后，創面達臨床愈合（圖5）。

圖5 含PBMC自體PRP治療非急性感染創面的典型病例2

3 討論

創面感染，尤其是亞急性、慢性感染，多為低毒性感染，病原體多為耐藥菌屬［4，7］。 創面常常經久不愈合，有時甚至出現惡性轉化，危害較大［15－16］。 傳統的治療時間長，往往需要多次清創手術并結合負壓吸引［2，4］。創面愈合其實是一種組織再生過程，這個過程需要有干細胞和生長因子參與［6］。臨床上，慢性創面難以愈合的原因很多，與患者自身營養狀態、免疫力、病原體毒性以及創面的組織結構、血液循環等情況密切相關［6－7，17］，而生長因子缺乏是創面難以愈合的重要原因之一［17－18］。另一方面，導致慢性炎癥的病原體多為低毒性病原體感染，免疫原性不強，同時機體免疫細胞常常難以到達病原體，以至于創面經久不愈［6－7］。本研究中，病例大部分的病原體也是低毒性但卻耐藥的細菌，因此，傳統治療效果一般。

PRP 中包含了高濃度的細胞生長因子［10－11］，而外周血單個核細胞主要成份包括白細胞、吞噬細胞、樹突狀細胞和骨髓基質干細胞［19］，這些成份為組織修復和抗感染提供了傳統治療方法無法具備的必要條件。血小板激活后，大量生長因子釋放，除了其本身能夠促進組織細胞再生、血管增生和上皮化以修復創面［20－21］，還可以通過趨化因子幫助中性粒細胞和免疫細胞生成活性氧化代謝產物，抑制或殺滅病原體，吸收壞死組織，為組織細胞遷徙提供空間和條件［22－23］。單核細胞中有含有骨髓來源的基質干細胞，他們具有多向分化潛能，能夠在特定細胞分化因子和生長因子調節下演化為血細胞和組織細胞，分泌相關生物蛋白，為創面的修復提供種子細胞和生物材料［22－24］。另一方面，單核細胞的存在為血小板生長因子的激活提供了更好的局部環境［22－24］。

應用PRP治療各種創面的療效在國內外早已證實［11，18］，其起效機制也有研究，主要是通過含高濃度的生長因子，并且各種生長因子的所占比例與自體內的比例基本一致，其安全性也是肯定的。在臨床應用中，我們首次結合了血液中的單核干細胞一起應用于非急性感染創面。本研究結果表明，與非PRP治療組相比，應用PRP治療后，各炎癥指標WBC、hs?CRP、ESR、PCT、A／G 等在治療后首次復查時，hs?CRP、PCT和A／G恢復更好，WBC、ESR則無明顯差異。表明這可能與PRP、PBMC在創面局部發揮抑制炎癥和抗菌作用有關，未引起全身性的生理病理反應。這也進一步證實了PRP的抗炎作用，以及治療的安全性。因為血液中的hs?CRP和PCT主要由細菌內毒性引起的機體應激反應產生，他們直接反應創面局部的炎癥情況。A／G比例趨于好轉，可能與自身免疫狀態、住院期間患者營養得到改善有關。Hs?CRP是反應組織損傷和恢復的敏感指標［25］。PCT是一種新的炎性介質，是用于檢測細菌感染所致炎性反應的較好指標之一，對于病毒感染、腫瘤、自身免疫性疾病及局部感染患者，PCT水平維持在正常范圍內或者有輕度升高。隨著感染性疾病嚴重程度的增加，PCT水平也明顯升高，經有效抗菌藥物治療后，PCT水平迅速下降［26－27］。這兩種感染標志物與患者的創面預后密切相關。

體外實驗［11］也表明PRP對細菌有明顯的抑制作用。當細菌的炎癥反應被PRP有效抑制后，hs?CRP和PCT這兩個炎癥指標首先得到改善；而WBC、ESR是炎癥引起的一個后續全身性的反應。之所以這三項指標在首次復查時非PRP組與自體PRP組患者恢復的差異不明顯，可能與患者長期處于慢性炎癥狀態有關。最終的結果表明，應用了自體PRP的病例組愈合時間更短，創面達到臨床愈合的出院率更高，尤其是含PBMC的自體PRP。且各組病例均未出現感染加重、敗血癥、創面惡化等情況。雖然對于非感染性創面臨床應用含白細胞自體PRP治療還有爭議［12］，但本研究的結果表明，含PBMC的自體PRP能夠促進非急性感染創面愈合，且比傳統方法的治療效果更好。同時與單純自體PRP相比，安全性與可靠性更高。

雖然創傷后慢性感染性創面采用傳統方法治療也能夠達到一定療效，但仍然有愈合慢、花費大、恢復時間長，部分患者在住院期間難以達到臨床愈合的問題。自PRP在臨床上應用以來，大量臨床數據和研究都表明，PRP 能夠促進創面愈合［9－11，18］。 本研究結果也表明，應用自體PRP后，患者創面的愈合時間縮短，創面臨床治愈出院率明顯提高，不僅沒有增加住院費用，反而能夠減少住院費用，其主要原因可能是患者自體PRP治療后創面局部的炎癥被有效抑制［11］；此時，雖然抗生素應用的種類與傳統治療無明顯區別，但其可以明顯減少抗生素的使用時間、住院時間。這兩個病例組需要的傳統手術處理方式如負壓吸引、皮膚牽拉器以及他們配套的醫用生物材料等也相應減少了，因此住院費用也就減少了，從而減輕了患者的經濟負擔。而且，本研究還發現，含PBMC的自體PRP在住院時間、抗生素使用時間、住院總費用等指標上比單純自體PRP效果更好。創傷后非急性感染患者的感染主要局限于創面，血液中不含病原體，但因炎癥刺激機體血液中的白細胞、淋巴細胞、吞噬細胞、單核細胞持續升高［28］，未能在病灶發揮清除病原體的作用。采用含PBMC的自體PRP在創面注射意味著直接將血液中的含單核細胞和白細胞的高濃度生長因子作用于創面，消除了機體本身的物理障礙，這可能是含PBMC自體PRP產生較好臨床效果的機制。

當然，因為本研究主要是回顧性的病例研究，而且納入的病例主要是由創傷后引起創面的非急性感染病例，因此病例數較少。還有，因炎癥指標在臨床中復查的時間標準不一，我們僅采用治療前和治療后首次復查結果進行對比分析。該研究結論還需要進一步的前瞻性設計的研究結果支持。另外，對于急性感染的患者，因病原體細菌可直接進入機體血液，因此暫不宜使用該方法。從目前應用的結果來看，含PBMC自體PRP對于創傷性的非急性感染創面治療效果較好，具有臨床應用價值，值得推廣。

【參考文獻】

［1］陳 欣.淺談難愈性創面的外科治療［J］.中華損傷與修復雜志（電子版），2014，9（1）：9－12.

［2］夏擁軍.骨科創傷中關于持續封閉負壓引流的臨床效果觀察［J］.中國傷殘醫學，2017，25（14）：54－55.

［3］張鮮英，劉 毅，張緒生，等.難愈性創面的外科治療［J］.中國美容醫學雜志，2008，17（10）：1444－1446.

［4］王 嶺.封閉式負壓引流技術治療骨科創傷感染臨床研究［J］.中國傷殘醫學，2016，24（8）：59－60.

［5］張 斌，劉 毅，李 勤，等.臀部及下肢難愈性創面的整形外科綜合治療［J］.中國美容醫學雜志，2010，19（9）：1269－1271.

［6］常 菲，楊長偉，路 衛.難愈創面的發生機制和治療進展［J］.第二軍醫大學學報，2007，28 （11）：1259－1261.

［7］程紅纓，郝 娜.幾種難愈創面的發生原因與發病機制［J］.創傷外科雜志，2011，13（4）：368－370.

［8］ Xie X，Wang Y，Zhao C，et al.Comparative evaluation of MSCs from bone marrow and adipose tissue seeded in PRP?derived scaffold for cartilage regeneration ［J］.Biomaterials，2012，33 （29）：7008－7018.

［9］ Xie X，Ulici V，Alexander PG，et al.Platelet?rich plasma inhibits mechanically induced injury in chondrocytes［J］.Arthroscopy，2015，31（6）：1142－1150.

［10］謝雪濤，施忠民，張長青.富血小板血漿的制備與臨床應用研究進展［J］.中華創傷骨科雜志，2014，16（4）：311－315.

［11］李 明，章軍輝，李淑敏，等.應用自體富血小板血漿治療慢性難愈性創面的實驗研究［J］.中華關節外科雜志，2016，10（6）：624－629.

［12］張長青，袁 霆.富血小板血漿在臨床應用中的爭議與研究進展［J］.中華關節外科雜志，2016，10（6）：588－591.

［13］紀雪亮，易先鋒，藍 蔚，等.人臍血間充質干細胞促進燒傷創面愈合的研究［J］.中國傷殘醫學，2016，24（8）：35－36.

［14］ Aghaloo TL，Moy PK，Freymiller EG.Investigation of platelet?rich plasma in rabbit cranial defects： A pilot study［J］.J Oral Maxillofac Surg，2002，60（10）：1176－1181.

［15］丁 燕，南 娟，劉 謙.慢性炎癥、腫瘤微環境與癌變［J］.中國肺癌雜志，2009，12（9）：1022－1031.

［16］姚 靜，胡 容，郭青龍.炎癥與癌癥的發生發展［J］.藥物生物技術，2011，18（4）：372－376.

［17］程天民，胡友梅.創傷難愈的主要原因與發生機制［J］.中華創傷雜志，2004，20（10）：577－580.

［18］ Carter MJ，Fylling CP，Parnell LK.Use of platelet rich plasma gel on wound healing：a systematic review and meta?analysis［J］.Eplasty，2011，11：e38.

［19］王 曉，裴雪濤，李 梁.臍血CD34細胞和外周血單核細胞兩種來源的樹突狀細胞特性的比較研究［J］.中華血液學雜志，1999，21（11）：583.

［20］ Kon E，Mandelbaum B，Buda R，et al.Platelet?rich plasma intra?ar?ticular injection versus hyaluronic acid viscosupplementation as treat?ments for cartilage pathology：from early degeneration t osteoarthritis［J］.Arthroscopy，2011，27（11）：1490－1501.

［21］ Filardo G，Kon E，Di Martino A，et al.Platelet?rich plasma vs hyalu?ronic acid to treat knee degenerative pathology：study design and pre?liminary results of a randomized controlled trial［J］.BMC Musculo?skelet Disord，2012，13：229.

［22］ Fu Y，Ma D，LiuY，et al.Tissue factor pathway inhibitor gene trans?fer prevents vascular smooth muscle cell proliferation by interfering with the MCP?3／CCR2 pathway ［J］.Lab Invest，2015，95（11）：1246－1257.

［23］孔令爽，柴克霞.單核細胞趨化蛋白3研究進展［J］.醫藥前沿，2016，6（26）：11－12.

［24］程仁洪，鄭健新，張 偉.骨髓間充質干細胞輸注對膿毒癥大鼠促炎因子和心功能的影響［J］.轉化醫學電子雜志，2017，4（6）：20－25.

［25］孟衛東，陳雙峰.高敏C?反應蛋白的研究現狀［J］.國際檢驗醫學雜志，2010，31（4）：346－348.

［26］魏菊花，王永娣，杜波.降鈣素原在細菌感染診斷中的價值［J］.轉化醫學電子雜志，2016，3（7）：86－87.

［27］王智慧，祝嘯先.降鈣素原臨床研究進展［J］.疾病監測與控制，2013，7（11）：680－683.

［28］張 莉，杜 冠.炎性細胞因子抑制劑高通量篩選方法的研究［J］.中國藥理學通報，2003，19（11）：1260－1263.