鍶元素對黑鯛幼魚耳石的標記效果分析

張 翼，姜亞洲，徐開達，蔣宏雷，焦海峰，張 輝，程家驊，李圣法

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業部東海與遠洋漁業資源開發利用重點實驗室，上海 200090；

2.浙江省海洋水產研究所，農業部重點漁場漁業資源科學觀測實驗站，浙江省海洋漁業資源可持續利用技術研究重點實驗室，浙江舟山 316021；3.寧波市海洋與漁業研究院，浙江寧波 315012）

增殖放流苗種標記作為開展增殖放流功效評估的重要基礎，也是制約功效評估精度的關鍵因素［1］。現階段，依據增殖放流物種的生物生態學特征，結合增殖放流功效評估的具體需求，研建生態高效的增殖放流苗種標記方法已成為增殖放流基礎科研領域的重要內容［2－3］。黑鯛（Sparus macrocephalus）是廣泛分布于我國沿海的島礁性近底層魚類，也是我國重要的增殖放流對象［4－7］。當前，國內黑鯛增殖放流工作以規模化放流小規格人工繁育苗種形式為主，受苗種規格、標志物經濟成本和標記過程時間成本等因素的限制，掛牌標記、金屬線碼標記和熒光色素可見式標記等傳統物理標記手段難以對其實施規模化標記操作，研建適用于小規格黑鯛增殖放流苗種的規模化標記方式已成為有效推進黑鯛增殖放流功效評估工作的當務之急。

耳石元素指紋分析技術的發展為上述標記需求提供了一種解決思路。耳石是沉積在真骨魚類內耳中的一種礦物結構，主要由碳酸鈣、蛋白質及一些微量元素組成。耳石中微量元素的含量與周圍水環境特征休戚相關，水環境中的相關元素經過代謝可穩定沉積在特定耳石區位，形成記錄魚體生活履歷的耳石元素指紋信息［8］。鍶（Sr）是魚類耳石元素指紋研究中的熱點元素，不僅被廣泛應用于魚類群體識別、生活環境重建等研究領域［9－11］，也被用作開展增殖放流魚苗耳石元素的指紋標記。在增殖放流魚苗的人工培育階段，通過階段性提升增殖放流魚苗飼養水體中鍶元素濃度，使其在處理魚苗特定耳石區位富集，即可實現對處理魚苗耳石的元素指紋標記。因該標記方法具備適用于小規格增殖放流魚苗的規模化標記操作、標記信息終生攜帶等技術特點，現已成為標記放流領域的探索熱點［12－14］。

本研究以黑鯛增殖放流魚苗為標記處理對象，通過開展基于鍶元素的耳石元素指紋標記實驗，探究不同濃度富鍶水體對黑鯛增殖放流魚苗耳石的元素指紋標記效果，研究標記處理過程對黑鯛存活率和生長狀況的影響，同時分析標記結束后鍶元素在標記魚苗肌體中的衰減規律，以期為利用該項技術開展黑鯛增殖放流魚苗規模化標記的可行性提供現實依據。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

基于鍶元素的黑鯛耳石元素指紋標記實驗于寧波市海洋與漁業科技創新基地進行。實驗對象為該基地人工繁殖培育、用以增殖放流的30日齡黑鯛魚苗，從中選擇體質健壯、規格整齊、體色正常的黑鯛作為實驗用魚［平均體長：（8.64±0.50）mm］。黑鯛魚苗養殖水體的鍶元素濃度為本標記實驗的處理因素，標記實驗共計設置4個標記處理組和1個對照組，每個處理組和對照組均設有3個平行樣，每個平行樣選用200尾實驗用黑鯛魚苗，分別置入容積為120 L的養殖容器進行實驗處理。對照組所用養殖水體為正常養殖用海水，其鍶元素濃度為6.07 mg·L－1；4個標記處理組所用富鍶養殖水體的鍶元素濃度分別為 18 mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1，分別通過向正常養殖用海水中人為添加SrCl2·6H2O加以配備完成。標記處理前，實驗魚苗在正常養殖水體進行2 d適應性暫養；隨后，按上述實驗設計調控養殖水體鍶元素濃度，開展標記處理，標記處理共計歷時7 d。標記處理結束后，將各處理組養殖水體的鍶元素濃度恢復至正常養殖海水水平，繼續飼養17 d，隨即結束實驗。實驗期間，實驗魚苗的餌料投喂和養殖設施管理均依實驗基地黑鯛魚苗培育規范操作。

實驗期間，在完成標記處理和實驗結束兩個時間節點分別統計各處理組和對照組黑鯛魚苗的平均體長和死亡率，用以分析標記處理過程對黑鯛魚苗生長狀況和存活率的影響。另，于標記處理結束、結束后3 d、10 d和17 d共計4個時間點分別從各平行樣隨機選取5尾黑鯛魚苗，置入玻璃器皿冷凍保存，用以后續檢測分析。此外，在實驗對象的增殖目標水域-象山港采集黑鯛當齡野生幼體30尾，用以驗證標記處理個體與增殖水域野生黑鯛幼體是否存在耳石元素組成差異。

1.2 樣品處理

所取黑鯛樣本經體長和稱重測量后，取出矢耳石，用于耳石元素測定；黑鯛肌體經微波消解儀消解后，利用Thermo X Series II ICP-MS進行肌體鍶元素含量分析。

耳石樣本經研磨、拋光處理，制成可觀測到耳石核心的厚度約為0.5 mm的耳石薄片，采用激光燒蝕聯動的電感耦合等離子質譜儀（LAICP-MS）對耳石樣本進行元素分析。利用NewWave 213激光剝蝕系統沿長軸半徑從耳石核心至邊緣進行激光線掃描剝蝕后（圖1），通過Thermo X Series II ICP-MS進行鍶、鈣測定。在無任何樣品條件下對 Ar、He混合氣體進行 LAICPMS測試，重復10次，3倍空白標準偏差所對應的濃度即為各元素的檢出限，以確定 LAICPMS的元素檢測限水平。檢測標樣為USGS MACS-3碳酸鹽標樣。激光剝蝕的波長為213 nm，剝蝕孔徑為32μm，剝蝕深度為20μm，激光移動速度為20μm·s－1。

圖1 黑鯛耳石及元素檢測分析路徑Fig.1 Map showing the sagitta of juvenile Sparus macrocephalus and line transect for element analysis注：C為耳石核心；L為耳石長軸；W為耳石短軸；R為半徑Note：C：sagitta core；L：long axis of sagitta；W：minor axis of sagitta；R：radius

1.3 數據分析

Sr／Ca摩爾比值是基于鍶元素耳石元素指紋分析的基礎數據。依據上述檢測分析結果，首先計算獲取各檢測樣本從耳石核心至耳石邊緣的Sr／Ca值；然后，通過對比分析各處理組和對照組魚苗在耳石標記目標區位的Sr／Ca值差異，闡釋標記處理效果。耳石元素指紋標記成功的判別標準參考同位素的判別方式，如下［15］：在耳石標記目標區，存在超過3倍激光剝蝕孔徑長度的耳石區位，其任意點位Sr／Ca值均超過標記檢測基線。標記檢測基線設定為對照組個體在相應耳石區位Sr／Ca值均值與其3.3倍標準差之和。

本研究利用t檢驗和單因子方差分析（ANOVA）檢驗標記處理后各處理組和對照組魚苗存活率和肌體鍶元素含量差異，用以分析標記過程對處理魚苗存活率和肌體鍶含量的影響。

2 結果與分析

2.1 標記組和處理組個體的Sr／Ca值

對野生黑鯛幼體和標記實驗對照組黑鯛魚苗耳石的Sr／Ca值檢測分析結果顯示：上述耳石樣本從耳石核心至邊緣（沿矢耳石長軸半徑，下同）的Sr／Ca值均變異幅度較小，基本保持穩定（圖2）。野生黑鯛幼體和標記實驗對照組黑鯛魚苗耳石在檢測路徑上的Sr／Ca值分別為1.91±0.21和2.02±0.35，t檢驗顯示：兩者不存在顯著性差異（P＞0.05）。

對標記處理結束后17 d所取的處理組黑鯛魚苗進行耳石元素檢測結果顯示：與對照組相比，各處理組樣本在距耳石核心約330μm處，Sr／Ca值開始明顯升高，并在距耳石核心約400～480μm處形成一個相對平穩的峰，隨后Sr／Ca比值開始下降，并逐漸恢復至對照組水平，該Sr／Ca值增高區段即為富鍶水體標記處理所形成的耳石元素指紋標記區段。18 mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1標記處理組黑鯛魚苗在標記區段峰值區的Sr／Ca均值分別為：（5.57±0.22）mmol·mol－1、（7.21±0.19）mmol·mol－1、（10.40±0.39）mmol·mol－1和（10.59±0.37）mmol·mol－1，其均值分別為標記實驗對照組的2.76倍、3.57倍、5.15倍和5.24倍。

本研究以Warren-Myers等設定的耳石元素指紋成功標記判別標準對各處理組的標記成功率進行檢測。依實驗對照組耳石樣本的Sr／Ca均值及其標準差數據求得鍶元素指紋成功標記檢測基線值為 3.235 mmol·mol－1；依耳石元素檢測分析時激光剝蝕孔徑求得有效標記寬度下限為96μm。對不同標記處理組各15尾黑鯛樣本檢測分析發現，各檢測樣本的有效標記寬度均大于96μm，其均值分別為（180.5±13.3）μm（18 mg·L－1標記處理組）、（199.7±28.9）μm（24 mg·L－1標記處理組）、（191.7±16）μm（30 mg·L－1標記處理組）和（256±62.2）μm（36 mg·L－1標記處理組）。基于上述，各標記處理過程對黑鯛魚苗耳石元素指紋的標記成功率均為100%。

圖2 標記組、對照組和野生黑鯛幼魚耳石的Sr／Ca值Fig.2 Typical changes in otolith Sr／Ca ratio along line transects from the core to the edge in the wild，control and marked juvenile Sparus macroce phalus otoliths

2.2 標記組和處理組個體死亡率和生長狀況

經7 d標記處理，實驗對照組、18 mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1標記處理組黑鯛魚苗的平均死亡率分別為21.9%、23.9%、23.3%、22.3%和 26.5%（表 1）。單因子方差分析（ANOVA）結果顯示，各處理組與實驗對照組黑鯛魚苗的死亡率無顯著性差異（F＝0.745，P＝0.582）；標記結束 17 d后，實驗對照組、18 mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1標記處理組黑鯛魚苗的平均死亡率分別為34.5%、30.3%、28.6%、34.8%和35.4%。單因子方差分析結果顯示，此時段各處理組與實驗對照組黑鯛魚苗的死亡率依然無顯著性差異（F＝1.345，P＝0.320）。上述結果表明：標記處理過程對黑鯛苗種存活率無顯著負影響。

標記處理后，實驗對照組、18 mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1標記處理組黑鯛魚苗的平均體長分別為16.3 mm、17.1 mm、18.2 mm、16.5 mm和17.9 mm。單因子方差分析結果顯示，各處理組與實驗對照組黑鯛魚苗的平均體長無顯著性差異（F ＝2.080，P＝0.090）；標記結束17 d后，實驗對照組、18 mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1標記處理組黑鯛魚苗的平均體長分別為28.0 mm、26.7 mm、25.7 mm、27.3 mm和26.3 mm，單因子方差分析結果顯示，此時段各處理組與實驗對照組黑鯛魚苗的平均體長依然無顯著性差異（F＝1.698，P＝0.155）。上述結果表明：標記處理過程對黑鯛魚苗生長狀況不產生顯著負影響。

表1 標記處理后對照組與處理組黑鯛的死亡率和體長均值及標準差Tab.1 Mean value and standard deviation of mortality rate and body length of control and marked juvenile Sparus macrocephalus after marking treatment

2.3 標記組和處理組個體肌體內的鍶元素含量

標記處理結束當天，對照組、18mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1標記處理組黑鯛肌體內的鍶濃度均值分別為52 mg·kg－1、138 mg·kg－1、264 mg·kg－1、277 mg·kg－1和346 mg·kg－1（表 2），t檢驗顯示：各標記處理組黑鯛肌體內鍶濃度均與對照組存在顯著性差異（P值均小于0.05）；表明標記處理過程可使標記處理個體肌體內鍶濃度顯著提升。

隨時間推移，各標記處理組黑鯛肌體內鍶濃度逐漸下降。至標記處理結束17 d，18 mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1標記處理組黑鯛肌體內的鍶濃度均值分別降至45.5 mg·kg－1、76 mg·kg－1、91.6 mg·kg－1和106 mg·kg－1（表 2）。t檢驗顯示：該時段 18 mg·L－1標記處理組黑鯛肌體內鍶濃度已與對照組個體不存顯著性差異（P＞0.05）；表明該處理組黑鯛肌體內鍶濃度已恢復至正常水準。

表2 標記處理后不同時段黑鯛肌體中的鍶濃度均值和標準差Tab.2 Mean value and standard deviation of strontium concentrations of body tissues for the control and marked juvenile Sparus macrocephalus

3 討論

小規格增殖放流魚苗的規模化標記問題長期是水生生物增殖放流關鍵技術研究領域的一大難點。針對此類增殖放流魚苗，理想化的標記技術應具備苗種規格限制小、便于規模化操作、較少的標記操作損傷和較長的標記攜帶周期等技術特點［16－17］。目前，基于鍶元素的耳石元素指紋標記是研建此類標記技術的重要探索方向，該標記技術所采用的“浸泡”式標記方式以及標記元素在耳石中的代謝惰性使其本身具備有標記苗種規格限制小、便于規模化操作和標記信息攜帶長久等技術優勢［18］。本研究通過開展基于鍶元素的黑鯛耳石元素指紋標記實驗，進一步實證了不同濃度富鍶水體對黑鯛增殖放流魚苗耳石的元素指紋標記效果，明確了標記處理過程對受試魚苗死亡率和生長狀況的影響方式，驗證了利用該項技術開展小規格黑鯛增殖放流魚苗規模化標記的可行性。

3.1 富鍶水體對黑鯛幼魚耳石的標記效果

本研究利用富鍶水體對黑鯛增殖放流魚苗進行耳石元素指標標記實驗，預期標記效果為在受試黑鯛魚苗相應耳石區位形成易被鑒別的Sr／Ca值標記。以前期同類研究為參考［15］，本文將受試魚苗成功標記的判別標準設定為存在超過3倍激光剝蝕孔徑長度的耳石區位，其任意點位Sr／Ca值均超過標記檢測基線（即對照組個體在相應耳石區位Sr／Ca值均值與其3.3倍標準差之和）。本研究結果顯示，經7 d的標記處理，各處理組黑鯛魚苗耳石均能形成了與對照組或野生個體的Sr／Ca值差異；依上述成功標記判別標準，本研究所用的標記處理方式對黑鯛魚苗耳石的標記成功率均為100%。

從本研究所采用的標記處理過程看，標記水體鍶元素濃度和標記處理時間是影響受試魚苗耳石標記效果的核心要素。理論上講，標記水體鍶濃度越高，所形成的標記強度（標記區段處理組個體與對照組個體的Sr／Ca值差異大小）越大；標記處理時間越長，所能標記的耳石范圍越廣［18］。本研究發現，無論從標記強度還是標記范圍上看，各處理組均明顯高于成功標記所需標記強度和標記范圍的最低閾值。從降低標記處理的經濟、時間成本的角度考量，標記水體的鍶元素濃度和標記處理時間均有進一步壓縮的空間；至于具體壓縮的程度，有待進一步實驗確認。

3.2 標記處理過程對受試黑鯛死亡率和生長狀況的影響

標記操作對魚體的損傷大小是選擇適宜標記方法的重要考量因素。掛牌標志、金屬線碼標記等傳統物理標記方法因會給標記對象帶來個體創傷和額外的代謝負擔，嚴重制約了其適用范圍［19－20］。本研究結果顯示，各標記處理組與對照組黑鯛魚苗的死亡率和生長狀況均無顯著性差異，這表明利用鍶濃度在18～36 mg·L－1范圍內的富鍶水體對黑鯛魚苗進行標記處理不會對受試魚苗的存活和生長產生顯著負面影響，標記過程不會產生操作損傷。

鍶元素廣泛存在于自然界中，鍶離子與鈣離子在魚體內具有相同的運輸離子通道、相似的化學性能，但其在水生生物內的生理作用至今尚未明確［21］。文獻檢索發現，不同水生生物物種、不同個體發育階段對富鍶水體的響應方式各異。PILLARD等［22］研究發現：伴隨飼養水體中鍶濃度提升，巴西擬糠蝦（Mysidopsis bahia）和雜色鳉（Cyprinodon variegatus）的存活率并未出現異常，但美洲原銀漢魚（Menidia beryllina）的死亡率卻大幅提升。PYLE等［23］研究發現水體中的鍶元素濃度與黑頭呆魚（Pimephales promelas）魚類孵化率具有顯著相關性，但與其幼苗生長和存活率關系不緊密。宋洪建等［21］研究發現，當飼養水體中鍶濃度提升至30～40 mg·L－1時，大馬哈魚（Oncorhynchus keta）稚魚肌肉中Ca2＋－ATP酶和Na＋／K＋－ATP酶的活性受到抑制，生長和死亡率受到影響。基于上述，建議在尚未系統掌握鍶元素的生理作用及生態毒理效應之前，利用富鍶水體開展增殖魚苗耳石元素指紋標記時應盡量控制鍶元素濃度的提升幅度。

3.3 標記處理過程對受試黑鯛肌體中鍶含量的影響

黑鯛標記放流魚苗進入增殖水域后有部分個體會被人類回捕用以食用消費。鑒于此，不產生額外的食品安全問題應作為選擇黑鯛增殖放流苗種標記方法的一項基本準則。現階段，鍶元素對人體的影響方式仍不甚明確［24－25］，尚無相關食品安全標準對水產品鍶元素含量攜帶閾值進行界定，為避免產生因標記行為帶來相關食品安全問題，標記放流個體的鍶含量應與對照個體盡量保持一致。

本研究發現，經7 d的富鍶水體處理，受試黑鯛肌體內的鍶含量顯著提升，且提升幅度與標記水體中的鍶濃度顯著相關，標記水體中鍶濃度越高，受試黑鯛肌體對鍶元素的富集程度越大。但與此同時，值得關注的是，與耳石中鍶元素一旦富集難以被異化吸收的情景不同，伴隨標記處理結束，各標記處理組黑鯛肌體中的鍶含量均呈現不斷衰減的趨勢。至標記結束17 d，18 mg·L－1標記處理組黑鯛肌體中的鍶元素已降至實驗對照組水平；其它處理組黑鯛肌體中的鍶元素亦較標記處理結束時大幅降低，受實驗周期限制，24～36 mg·L－1處理組恢復至正常水平的具體時間無法通過本研究獲取，需經后續研究進一步驗證。鑒于上述，在利用富鍶水體進行黑鯛增殖放流魚苗耳石元素指紋標記操作后，建議進行一定時期內的暫養，待其肌體中的鍶元素含量恢復至正常水準后再進行放流，以確保消除標記過程可能產生的食品安全隱患。

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