植物逆境相關RING finger蛋白的研究進展

田麗 包滿珠 張蔚

摘要：鋅指蛋白是植物轉錄因子中的一個大家族，RING finger蛋白屬于其中一個分支，具有環狀結構域的典型特征結構，在植物生長發育以及響應逆境脅迫等方面起著重要作用。主要綜述了RING finger蛋白的結構特點、分類和亞細胞定位，重點概括了RING finger蛋白在參與非生物與生物脅迫耐受性等方面的研究成果，并對其進一步的深入研究進行了展望，為將來利用植物RING finger蛋白基因創造抗逆新種質提供參考。

關鍵詞：RING finger蛋白；鋅指；非生物逆境；生物逆境

中圖分類號：Q943.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）06-0005-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.06.001

Abstract： Zinc finger proteins form a relatively large family of transcription factors in plants. The RING finger proteins represent a subgroup of Zinc finger proteins that contain specialized structures of ring finger domain. Proteins containing RING finger domain（s） were found to play important roles in plant growth and development， as well as responses to stress. Here the structural characteristics， classification and subcellular localization of RING finger proteins were introduced， the recent functional characterization studies of RING finger proteins in response to abiotic and biotic stresses were mainly highlighted， and a prospect for further in-depth research was made， with the hope that a relatively comprehensive reference for the creation of new germplasm with stress resistance using plant RING finger proteins could be provided.

Key words： RING finger proteins； zinc finger； abiotic stress； biotic stress

鋅指蛋白最早在1985年由Miller等[1]在非洲爪蟾卵母細胞轉錄因子TFⅢA中發現，之后根據鋅指蛋白基序和結構的不同將其分為9大類：C2H2型、C4型、C6型、C8型、CCCH型、C2HC型、C2HC5型、C3HC4型和C4HC3型（H和C分別代表組氨酸和半胱氨酸）[2]（圖1）。RING finger蛋白是鋅指蛋白中一個龐大的蛋白家族，近年來植物鋅指蛋白報道較多的為C2H2型，而對RING finger型鋅指蛋白的研究相對較少。

前人研究表明RING finger蛋白廣泛參與植物細胞的各種生理生化過程。例如，Xu等[3]在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中發現RING-H2型基因RIE1是種子發育的重要基因。Schumann等[4]研究發現的過氧化物酶體膜蛋白PEX10（peroxin protein 10）是C3HC4型RING finger蛋白，參與到基質蛋白運輸，在過氧化物酶膜與類囊體膜信號傳遞過程中起到不可缺少的作用。水稻（Oryza sativa L.）中的RING-H2型鋅指蛋白OsBIRF1（Oryza sativa L. BTH-induced RING finger protein 1）既能提高植株抗干旱、抗病毒的能力，同時還能促進植株生長，具有多重效應[5]。目前，從植物、動物和微生物中都已分離得到 RING finger蛋白，但許多RING finger 蛋白的功能還不太明晰。本研究主要綜述RING finger 蛋白的結構特點、分類以及亞細胞定位，重點概括RING finger 蛋白在植物逆境脅迫應答中的作用，為后續展開更加廣泛深入的研究提供參考。

1 RING finger蛋白的結構特點與分類

RING finger domain是1991年從人類基因RING1（Really Interesting New Gene 1）蛋白中新發現富含半胱氨酸的鋅指結構域[6]，RING finger也由RING1基因首字母縮寫命名得來[7]。RING finger蛋白具有典型的環指結構域（RING finger domain），環指結構域中有富含半胱氨酸序列的基序，概括為Cys-X2-Cys-X9-39-Cys-X1-3-His-X2-3-Cys/His-X2-Cys-X4-48-Cys-X2-Cys，X可以為任意氨基酸[8]，能夠與兩個Zn2+結合形成典型cross-brace結構[9]（圖2）。根據第5位保守氨基酸為半胱氨酸或組氨酸，RING finger蛋白分別對應分為兩大類：RING-HC（C3HC4）和RING-H2（C3H2C3）[10]。RING-HC和RING-H2的區別在于共有序列中第5配位是半胱氨酸或是組氨酸。

迄今已在植物中發現了許多RING finger蛋白。利用生物信息學分析的方法，Lim等[11]從水稻中共檢索獲得488個潛在的RING finger基因，在確定了425個RING finger基因分布的基礎上，將其分為RING-H2（281個）、RING-HC（119個）、RING-v（23個）和RING-C2（2個）共計4種類型。Liu等[12]從毛果楊（Populus trichocarpa）中118個候選的C3HC4型RING finger蛋白基因里鑒定出了91個C3HC4型RING finger基因。Alam等[13]從蕪菁（Brassica rapa）的基因組中鑒定了715個RING finger蛋白。

2 RING finger蛋白的亞細胞定位

植物RING finger蛋白大多定位于細胞核、細胞質或者細胞膜，如：擬南芥C3H2C3型RING finger蛋白RFI2（Red and Far-red Insensitive 2）[14]、C3HC4型RING finger蛋白DRIP1（DREB2A-INTERACTING PROTEIN 1）[15]、中國野生華東葡萄（V. pseudoreticulata）VpUIRP2蛋白[16]、玉米（Zea mays）ZmRFP1（Oryza sativa cold-inducible）蛋白[17]等。

也有部分蛋白位于內質網等其他地方，如：辣椒（Capsicum annuum）Rma1H1（RING membrane-anchor 1 homolog 1）蛋白[18]、水稻OsHCI1（Oryza sativa heat and cold induced 1）蛋白[19]等（表1）。

3 RING finger蛋白的功能

RING finger蛋白可以發揮轉錄因子的作用，在植物體內主要是通過與DNA/RNA結合或蛋白互作進行轉錄調控，部分RING finger蛋白還能起到E3連接酶的作用以調節植物體內蛋白水解等[26]。已知RING finger蛋白廣泛參與植物細胞的各種生理生化進程，包括生長發育[27，28]、開花[29]、細胞體內的信號傳遞[30]、植物與細菌、病原體親和或不親和互作以及逆境脅迫應答[31]等過程。而RING finger蛋白在非生物與生物逆境脅迫響應過程中的作用尤為重要。

3.1 RING finger蛋白參與應答非生物脅迫

非生物脅迫主要包括高溫、低溫、干旱、鹽堿、氧化脅迫等，是影響植物分布和農作物生產的主要環境因素。植物在漫長的進化過程中，產生了眾多不同的非生物逆境應答與調控方式，發掘關鍵抗逆基因，解析抗逆機制，不僅可用于植物抗逆性的遺傳改良，還將極大地豐富人們對植物非生物逆境脅迫應答的認識，為相關基因在植物抗逆遺傳改良中的合理利用提供科學依據和理論基石。近年來很多研究結果表明，RING finger蛋白參與應答各種非生物脅迫（表2）。

3.1.1 RING finger蛋白在滲透脅迫中的作用 滲透脅迫主要是指植物由于環境因素無法獲得充足的水分而造成的脅迫。植物體內的生命活動都直接或間接地需要水分的參與，滲透脅迫能夠破壞植物細胞的正常離子分布動態平衡，長時間則對植株的生長發育等造成巨大的損害。這里主要概括RING finger蛋白在干旱和鹽滲透脅迫中的作用。

至今，已在多個物種中發現RING finger蛋白參與滲透脅迫的應答。Kam等[35]從小麥（Triticum aestivum）中發現鋅指蛋白TaRZF70具有4個RING-H2結構。小麥遭受干旱脅迫時，其在葉片中的表達量上升，在根部的表達量卻下降，說明TaRZF70的表達具有組織特異性，并推測TaRZF70蛋白的4個RING-H2結構能作用于不同的靶蛋白。沙蒿（Artemisia desertorum）AdZFP1蛋白的N末端具有錨蛋白重復序列區域，C末端具有C3HC4型RING finger結構。干旱處理后，AdZFP1在根、莖、葉等多個器官內的表達量上升。將AdZFP1在煙草植株中異源表達，能增強植株的抗旱性[31]。吳學闖等[23]利用核蛋白篩選系統，從干旱脅迫大豆cDNA文庫中篩選出C3HC4型RING finger蛋白基因GmRZFP1。該基因能被干旱、高鹽等脅迫誘導表達，表明GmRZFP1涉及多種脅迫相關信號傳導途徑。Reis等[33]用NaCl處理離體木薯（Manihot esculenta Crantz）葉片時發現MeRZF（Manihot esculenta RZF）表達量增加，推測MeRZF在響應鹽脅迫時有著潛在的作用。Cheng等[43]在擬南芥中發現RGLG2能與AtERF53在細胞核內相互作用，通過調節AtERF53（ETHYLENE RESPONSE FACTOR53）的轉錄活性來負調控干旱脅迫響應。

已知部分RING finger蛋白依賴于ABA途徑進行調控。Ko等[32]研究發現XERICO（Greek for ‘drought tolerant）在擬南芥的根、莖和葉等多個器官中有表達。轉基因植株在干旱處理下，ABA的生物合成量遠遠高于野生型植株，同時失水率也要低于野生型。觀察葉片氣孔狀態時還發現，轉基因型氣孔多數關閉，而野生型多數為開放狀態，表明轉基因植株通過增加ABA 含量控制葉片氣孔的關閉，以減少水分來提高抗旱能力。辣椒中分離出的基因CaRFP1能被NaCl和甘露醇迅速誘導。過量表達CaRFP1的植株在種子萌發期對NaCl和甘露醇的處理很敏感，萌發率顯著低于野生型，但在幼苗生長期時滲透脅迫對植株影響變小，推測不同生長期對滲透脅迫的敏感程度不同，這可能是不同生長期對ABA的響應有差異造成，即CaRFP1參與依賴ABA的信號途徑[10]。水稻T-DNA突變體osdsg1（Oryza sativa delayed seed germination 1）中，ABA信號相關基因的表達量顯著提升。并且，相較于野生型，osdsg1突變體與OsDSG1-RNAi植株更加耐高鹽和干旱，推測OsDSG1（Oryza sativa Delayed Seed Germination 1）依賴ABA途徑負調控植物抗旱性。

部分RING finger蛋白能夠發揮E3泛素連接酶的作用，通過單泛素化或多聚泛素化修飾靶蛋白，調控植物對滲透脅迫的響應。Qin等[15]利用響應干旱脅迫的重要基因DREB2A（The DEHYDRATION-RESPONSIVE ELEMENT BINDING PROTEIN2A）篩選擬南芥文庫，分離了2個C3HC4型RING finger蛋白DRIP1（DREB2A-INTERACTING PROTEIN 1）和DRIP2。試驗證明，DRIP1/DRIP2具有E3連接酶的作用，能在核內與DREB2A相互作用，并能水解DREB2A蛋白。drip1drip2雙突變體的耐旱性增強，且干旱脅迫響應基因的表達量也顯著上升。研究者推測，DRIP1和DRIP2通過26S蛋白酶泛素化調控DREB2A，對干旱響應起負調控作用。Lee等[18]發現，干旱脅迫下，辣椒Rma1H1基因的表達能被迅速誘導。在擬南芥中異源表達Rma1H1，植株的耐旱性顯著增強。酵母雙雜交和體外泛素化試驗證明，Rma1H1能與水通道蛋白PIP2；1相互作用，并能介導PIP2；1泛素化。研究者推測，Rma1H1及其擬南芥同源基因Rma1（RING membrane-anchor 1）通過抑制PIP2；1的運輸，降解PIP2；1蛋白，來下調細胞膜上PIP2；1的水平，從而調節植物抗旱性。目前已在多個物種中發現RING finger蛋白具有E3泛素連接酶活性，能參與特定的泛素化事件。前人報道中多以體外泛素化實驗證明目的蛋白是否具有E3連接酶作用，如擬南芥SDIR1（salt-and drought-induced RING finger 1）[36]，水稻OsBIRF1[5]、OsRDCP1（Oryza sativa RING domain-containing protein 1）[37]，玉米ZmRFP1[19]以及煙草NtRHF1（RING-H2 finger gene 1）[38]等，但其是否能在體內同樣發揮E3連接酶的作用，以及如何發揮作用還有待進一步研究。

3.1.2 RING finger蛋白在溫度脅迫中的作用 極端溫度使得植物的細胞膜流動性，膜的脂類成分，光合、呼吸作用，酶活性以及植株的代謝都遭受到損壞，從而影響植株的生長發育。

前人報道中，大部分RING finger蛋白依賴 ABA途徑響應低溫脅迫。水稻OsCOIN（Oryza sativa cold-inducible）基因的表達受低溫、干旱、鹽和ABA強烈誘導，OsCOIN的過量表達增強了植株對低溫、干旱和鹽脅迫的抗性，提高了OsLti6b和OsP5CS等冷脅迫相關基因的表達。其中，OsP5CS（delta1-pyrroline-5-carboxylate synthetase）是參與脯氨酸合成的一種酶，而脯氨酸對細胞滲透平衡有著重要作用。由此推測OsCOIN 依賴ABA途徑，通過調控冷相關基因的表達，增加細胞內脯氨酸含量，從而增強植物對低溫、干旱以及鹽的耐受性[20]。Jung等[21]發現蕪菁BrRZFP1（RING zinc finger protein from Brassica rapa）基因的表達能被低溫和ABA迅速誘導。過量表達BrRZFP1的煙草植株對低溫、干旱以及鹽脅迫的抗性增強。

此外，還有的RING finger蛋白，如擬南芥中的HOS1（high expression of osmoticstress-regulated gene expression 1），通過不依賴ABA的CBF途徑在植物抵抗低溫脅迫中發揮重要作用。HOS1的編碼產物是類似于C3H2C3型的RING finger蛋白，其RING finger domain中第一個氨基酸為亮氨酸，而非半胱氨酸[41，44]。已知CBF類轉錄因子是調控植物抗寒性的重要節點基因，當植物遭受低溫脅迫時，其上游調控因子ICE1（inducer of CBF expression 1）被激活，誘導CBF的表達，而后CBF基因表達產物與下游COR（cold-regulated gene）基因啟動子中的CRT/DRE（C-repeat binding factor/dehydration-responsive element binding protein）元件結合， 誘導系列抗冷基因的表達，從而增強植株的抗寒能力[45]。而HOS1蛋白具有E3泛素連接酶的作用。在低溫條件下，通過與ICE1相互作用，將 ICE1蛋白降解。體內和體外的實驗均證明，HOS1能直接將ICE1泛素化，多泛素化的ICE1蛋白通過26S蛋白酶途徑降解。與生化結果一致的是，超量表達HOS1的植株中CBF3以及下游的COR基因表達受到抑制，植株對低溫敏感[44]。

除上述響應低溫脅迫的RING finger蛋白以外，還有研究發現部分RING finger蛋白響應高溫脅迫，但目前報道的文獻不多。水稻OsRZFP34基因能被高溫和ABA所誘導，異源表達OsRZFP34的擬南芥植株中，很多參與Ca2+、K+和ABA信號傳遞的基因的表達量上升。并且，用外源ABA處理植株后發現，相較于對照，轉基因植株葉片上的氣孔張開程度更大。這證明了OsRZFP34是響應高溫和ABA的植物調節子。當植物暴露在高溫環境中時，OsRZFP34可促進氣孔開放，從而提高蒸發速率，利于植株散熱[39]。擬南芥RING finger基因AtHHR1被發現參與到了熱脅迫響應，實驗中對athhr1突變體、athhr1/AtHHR1互補株系及野生型進行45 ℃熱脅迫處理，發現athhr1的萌發率、葉綠素及脯氨酸含量高于野生型，而athhr1/AtHHR1株系均低于野生型，且熱誘導后擬南芥熱信號通路中相關熱激蛋白基因在突變體中表達比野生型高，初步證明了AtHHR1基因在擬南芥的熱脅迫響應中起負調控作用[40]。

3.2 RING finger蛋白參與應答生物脅迫

生物脅迫主要是指病蟲、真菌、細菌以及病毒等對植物的生長發育帶來的脅迫。已知RING finger蛋白可以通過調控防御相關基因的表達，激活防御機制來抵御潛在入侵的病原體。水稻基因OsZFP1能響應稻瘟病菌的侵染，其表達水平在稻瘟病菌Guy11孢子懸浮液接種水稻后緩慢升高，且OsZFP1過表達植株的整體抗稻瘟病能力得到顯著提高[46]。Liu等[5]發現的水稻OsBIRF1基因也增強了轉基因煙草對煙草花葉病毒及煙草野火病病菌的抗性，轉基因植株中PR蛋白以及氧化脅迫相關基因的表達量都有所增加。伍文憲等[47]在本生煙中克隆了C3HC4型RING finger蛋白NbZFP1，其過量表達的煙草植株對煙草花葉病毒的抗性要強于野生型，研究者推測NbZFP1可能通過正調控PR基因的表達來增強抗病性。

許多RING finger蛋白具有E3連接酶活性，可以水解蛋白，從而調控植物對生物脅迫的響應。Hong等[10]發現，超表達辣椒CaRFP1的轉基因擬南芥對番茄細菌性斑點病更加敏感，同時還伴隨著PR-2、PR-5等抗病相關基因的表達量降低，推測CaRFP1起到E3連接酶的作用，多聚泛素化水解PR蛋白。擬南芥中MIEL1與轉錄因子MYB30在細胞核中可發生互作，并導致MYB30的降解，從而降低MYB30轉錄激活的抗病相關基因的表達，抑制植物免疫反應[48]。Yu等[49]發現中國華東葡萄（Vitis pseudoreticulata）中RING finger基因EIRP1（E3 ubiquitin ligase Erysiphe necator-induced RING finger protein 1）參與到病原體防御響應。EIRP1能靶定并泛素化/26S酶蛋白系統水解負調控轉錄因子VpWRKY11，而轉錄因子VpWRKY11植物防御中起到負調控的作用，推測EIRP1發揮E3連接酶作用水解 VpWRKY11，從而能增強華東葡萄抗病原體的能力。但同樣來源于中國華東葡萄中RING finger基因VpUIRP2是通過響應水楊酸調控增強對白粉病的抗性[16]。

含有保守RING-H2結構域的ATL（Arabidopsis Toxicos en Levadura）家族也是通過E3泛素連接酶活性來介導植物的抗病反應。如擬南芥中的ATL9被發現在免疫反應中調控植株對活體營養型病原物的抗性[24]，而番茄（Solanum tuberosum L.）中的ATL相關基因RFP1（RING-finger protein 1）對于抵抗半活體營養型病原物Phytophthora infestans是必不可少的[50]。Berrocal-Lobo等通過蛋白質泛素化檢測，證實了ATL9具有E3連接酶的作用，推測外來病原體如白粉病能激活NADPH氧化酶活性，進而體內產生ROS和MAPK信號，誘導ATL9基因的表達，ATL9則泛素化水解某些抵抗病原的抑制蛋白，同時自身也被快速降解，從而開始防御響應[24]。還有的ATL基因依賴水楊酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）或乙烯（ethylene，ET）等信號途徑來調控生物脅迫的響應[51]。如番茄中ATL6能被誘導子誘導表達，其依賴于JA信號途徑進行調控[52]。Serrano等[53]發現擬南芥組成型表達ATL2的5個eca（expression constitutiva de ATL2）突變體能響應水楊酸、茉莉酸途徑，且存在著較大的不同。與JA-信號途徑相關的基因PDF1.2，其表達量只在eca2，eca4中大幅度上升；5個突變體中的防御相關基因ATLs有表達，但SA-信號途徑相關基因PR-1只在eca1中高水平表達，其他4個突變體中卻沒有表達。

4 展望

植物能夠適應多種逆境主要是通過改變其基因表達和代謝途徑來實現的，研究這些基因表達和功能對提高植物耐逆性具有重要意義[54]，因此植物對逆境脅迫響應機制一直是人們研究的熱點。雖然RING finger蛋白響應逆境脅迫的研究已取得了較大進展，但目前有關RING finger蛋白響應逆境的工作多數仍集中在RING finger蛋白基因的結構類型分析、組織及脅迫表達譜、亞細胞定位以及轉基因植株的抗性鑒定等方面，RING finger蛋白的調控機制尚未清楚闡明。并且，多數研究以擬南芥和水稻等模式植物為研究對象，由于同源基因在不同物種中的功能有可能出現分化，因此還有更多參與植物生物逆境脅迫響應的RING finger蛋白及其調控機制有待鑒定和研究。

蛋白質泛素化是植物體內蛋白質翻譯后重要修飾之一，其中泛素連接酶E3決定底物蛋白的特異性選擇。盡管已有許多證據表明一些RING finger 蛋白具有E3泛素連接酶活性，可以調控植物抗逆性，但其底物蛋白是哪些，是如何與底物蛋白相互作用的，是否識別具有相同特點的底物蛋白，E3泛素連接酶能否單泛素化、多泛素化或多聚泛素化修飾這些底物，這些問題還有待解答，深入探究泛素化調控抗逆反應的機制將為提高植物的抗逆性提供新的思路。

隨著現代全基因組測序技術的飛速發展，更多物種的全序列將被破譯，更多植物的RING finger蛋白將被鑒定。屆時利用生物信息分析手段，綜合運用功能基因組學、轉錄組學、蛋白質組學以及代謝組學等研究方法，將極大促進和推動RING finger蛋白基因的功能及作用機制研究，并最終加快植物抗逆基因工程育種的進程。

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