3種四環素藥物對創傷弧菌的抗菌活性

高 山， 梁 建， 李永仁， 馬云坤， 郭永軍

(天津農學院水產學院/天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津 300384)

隨著我國水產養殖業的發展，人們發現許多弧菌可引起人類和水產動物疾病，創傷弧菌為革蘭氏陰性的嗜鹽細菌，主要生長于近海口水中、魚類及貝類等體內[1]，是人畜共患的條件致病菌。鑒于弧菌病的危害性，尋找病原弧菌的主要防治和治療方法迫在眉睫。

創傷弧菌(Vibriovulnificus)，又稱為海洋弧菌，可從牡蠣等海產品中分離得到，是一種棲息于海洋中的細菌。主要通過傷口接觸海水造成感染，也可經口感染，導致菌血癥或敗血癥。將傷口暴露在含有該菌的海水中，創傷弧菌會在傷口上繁殖，可能引發潰爛，甚至導致組織壞死。若人食用了遭其污染的海鮮，也有患腸胃炎的可能。在2003年12月，中國臺灣衛生研究院主導的基因體定序團隊，完成了創傷弧菌的基因體定序與分析工作。

各種抗生素在規模化動物養殖中用于防病治病、提高飼料利用率和促進動物生長。使用后抗生素通常以藥物原形隨糞尿排出[2-3]。研究表明，規模化養殖動物糞便普遍富含抗生素[4]，本試驗采用鹽酸土霉素、四環素、金霉素3種四環素類抗生素作用于創傷弧菌，以檢測比較該類藥物對創傷弧菌的抗菌效果。

鹽酸土霉素，別稱地霉素、氧四環素為廣譜抑菌劑，本品在水中易溶，在乙醇中略溶，在三氯甲烷或乙醚中不溶。

四環素，該鹽酸鹽為黃色結晶性粉末；無臭，味苦；有引濕性；遇光色漸變深，在堿性溶液中易破壞失效。在水中溶解，在乙醇中略溶，在三氯甲烷或乙醚中不溶。該品為廣譜抑菌劑，高濃度時具殺菌作用。

金霉素(chlortetracyline，簡稱CTC)是四環素類廣譜抗生素的一種。鹽酸金霉素在20世紀40年代被發現并展現出良好的抗菌性質。由于鹽酸金霉素具有抗菌范圍較廣、療效顯著、價格便宜等優點[4]，因此在中國被廣泛用于畜禽、水生生物、藥物添加劑等產業，并能有效地預防和治療動物疾病，促進動物生長，提高飼料轉化率，防治動物腸道感染等，由此帶來可觀的經濟效益[5]。同時，由于鹽酸金霉素的廣泛使用甚至濫用，導致細菌耐藥性的增加等一系列問題，給人類疾病控制和環境控制帶來難題[6]。另外，食用含鹽酸金霉素殘留的動物食品及其制品后，多數會引起胃、腸、肝臟的損害與牙齒的染色以及過敏反應、二重感染、生殖毒性[7]等，嚴重時甚至還會出現中毒死亡現象。

四環素類抗生素具有良好的抗菌效果，但是對于水產致病菌的抗菌效果報道較少， 本試驗通過3種四環素類藥物對

海水創傷弧菌抗菌效果的觀察測定，找出該3種藥對創傷弧菌的最低抑菌濃度和殺菌濃度，為養殖生產實踐中創傷弧菌的預防和治療提供技術參數。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

海水創傷弧菌由天津農學院水產養殖實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 陳海水的配制 陳海水的配制：稱取28.571 4 g海水晶，用量筒稱取1 000 mL蒸餾水，將海水晶溶于燒杯中的 1 000 mL蒸餾水中，即為1 000 mL的陳海水。

1.2.2 培養基的制備 海水固體培養基的制備：稱取蛋白胨5 g、酵母膏1 g、磷酸鐵0.01 g、瓊脂粉16 g，置于燒杯中，量取1 000 mL陳海水，倒入燒杯中，攪勻，調節pH值至7.6～7.8，均勻攪拌后，在電爐上加熱至完全溶解，分4份倒入4個三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋滅菌(30 min，121 ℃)，取出后在無菌條件下倒入平板備用。

海水液體培養基的制備：稱取蛋白胨5 g、酵母膏1 g、磷酸鐵0.01 g，置于燒杯中，稱取1 000 mL陳海水，倒入燒杯中，攪勻，調節pH值至7.6～7.8，均勻攪拌后，在電爐上加熱至完全溶解，分4份倒入4個三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋滅菌(30 min，121 ℃)，取出后在無菌條件下倒入試管中備用。

1.2.3 菌懸液的制備 采用平板劃線法，將待測菌接種于海水固體培養基上，于28 ℃培養12 h后，在無菌條件下用接種環將菌落刮入盛有無菌液體培養基的試管中備用。

1.2.4 菌液濃度的測定 在一定的范圍內濃度和吸光度呈線性關系。以分光光度計為檢測工具，將事先培養好的菌種用液體培養基溶解，將上層菌液倒入試管中，使其溶解搖勻便于測量。先配制一定濃度的細菌母液，另取15支試管依次加入9 mL液體培養基，利用10倍稀釋法稀釋。再將不同濃度的菌液在波長為600 nm條件下測量，記錄D600 nm，將第13、14、15支試管進行涂布后置于28 ℃培養箱中培養，24 h后觀察細菌生長情況并記錄，制得菌液濃度與D600 nm的關系曲線(圖1)。

1.2.5 3種水產抗菌藥物母液的配制 分別稱取鹽酸土霉素、金霉素和四環素各0.8 g，用50 mL容量瓶定容，則儲備液濃度均為16 000 mg/L，4 ℃儲存。

1.2.6 3種抗菌藥的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bacteridal concentration，MBC)的測定 采用濃度稀釋法測定MIC、MBC[8]。試驗設置3組平行，并設有2個對照組(即陽性對照與陰性對照)。每個濃度放入同一液體培養基5 mL，再加入相同濃度的細菌懸浮液各1 mL，后加入藥物儲備液，最后用蒸餾水將體積補至10 mL，振蕩均勻，作為試驗組。對照組中，取2支滅菌試管加入液體培養基5 mL，加入上述試驗組同一濃度菌液 1 mL，并加入4 mL蒸餾水，振蕩均勻，作陽性對照。另取2支滅菌試管加入液體培養基5 mL，藥物儲備液1 mL，并加入 4 mL 蒸餾水，振蕩均勻，作陰性對照，見表1。

表14種抗菌藥的濃度梯度對照

藥物的最終濃度依次為6 400、5 760、5 120、4 480、3 840、3 200、2 560、1 920、1 280、640、256、128、64和51.2 mg/L，培養前先測好陽性對照的D600 nm值，將所有試管置于28 ℃生化培養箱中培養12～18 h，觀察記錄抑菌結果，測定D600 nm，記錄無細菌生長試管中的最低藥物濃度，即為最小抑菌濃度(MIC)[9]。以陽性和陰性對照管為參照，記錄第1～15組細菌生長情況。觀察各試管中細菌生長情況，未見菌落生長的藥物濃度即為該藥對檢測菌的MIC。以上述相同方法測定標準菌的 MIC，同時分別做培養基(MH肉湯)，檢測細菌生長情況并作為對照。每次試驗每種藥均為3組平行，求其均值。測其MIC后，將未見細菌生長的各管旋渦混勻后，分別吸取 0.1 mL 傾倒于2個營養瓊脂平板上，28 ℃再培養18 h，計數菌落數，平均菌落數<5個的最小稀釋度的藥物濃度即為MBC[10]。

1.3 數據處理與統計分析

所有數據均用Excel 2003進行分析處理。利用Excel軟件制作各指標的標準曲線，并利用標準曲線計算得出各樣品中對應指標的活性含量。采用單因素ANOVA試驗法方差分析、配對樣本t檢驗法和LSD法比較差異顯著性。所有試驗數據用SPSS 19.0進行計算和統計，試驗數據以“平均數±標準差”表示，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 3種四環素類藥物對創傷弧菌的抗菌效果

2.1.1 鹽酸土霉素對創傷弧菌的抗菌效果 由表2可知，鹽酸土霉素濃度>2 560 μg/mL，抗菌效果明顯，菌落無生長。<2 560 μg/mL細菌生長逐漸增多，說明藥物對細菌的抑制效果逐漸減弱。在藥物濃度范圍為3 200～6 400、1 280～1 920 μg/mL 時，差異不顯著(P>0.05)，而3 200～6 400 μg/mL 與<2 560 μg/mL比較時，差異顯著(P<0.05)，并且隨著藥物濃度減小，細菌濃度逐漸增加。

表2鹽酸土霉素對創傷弧菌的抗菌效果

注：“-”表示無菌落生長，“+”表示生長菌落較多，“++”表示生長大量的菌落，“+++”表示生長的菌落最多；同列數據后標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表3、表4同。

2.1.2 金霉素對創傷弧菌的抗菌效果 金霉素對創傷弧菌的抗菌效果由表3可見。>1 280 μg/mL時，試管澄清；<1 920 μg/mL 時，出現渾濁，抗菌效果不明顯。隨著藥物濃度的減小，渾濁度增加，藥物此時只能抑制細菌的生長，不能夠完全殺死細菌。藥物濃度6 400 μg/mL與其他濃度相比，差異顯著(P<0.05)。64～1 280 μg/mL濃度下雖然菌落已經開始生長，但是彼此之間差異不顯著(P>0.05)。

2.1.3 四環素對創傷弧菌的抗菌效果 由表4可知，藥物濃度>1 920 μg/mL時，試管澄清，沒有細菌生長，抗菌效果明顯，當藥物濃度<1 920 μg/mL時，出現渾濁，細菌逐漸增長，藥物呈現出抑菌效果。藥物濃度在2 560～6 400 μg/mL，細菌無生長范圍時，抗菌效果明顯，與濃度51.2～1 920 μg/mL相比，差異顯著(P<0.05)。

2.2 3種四環素類抗生素對創傷弧菌的MIC、MBC比較

綜合表2、表3、表4可得到表5。

依據MIC和MBC的測定結果，鹽酸土霉素、金霉素、四環素3種藥物對海水創傷弧菌均有殺菌作用。但3種藥物對創傷弧菌的抗菌效果不同(圖2)，金霉素對于創傷弧菌最敏感，效果最明顯，相同細菌濃度時金霉素的藥物濃度最小，即金霉素的最小殺菌濃度MBC和最小抑菌濃度MIC最小。

3 討論

3.1 創傷弧菌抗菌研究

從20世紀70年代起，美國、荷蘭、丹麥等國家相繼有創傷弧菌感染臨床和流行病學方面的研究報道，早期研究抗生素對創傷弧菌的報道，多數是關于陸地動物的，關于水生生物的極少。相關學者用紅霉素、慶大霉素、四環素等多種抗生素在小鼠感染創傷弧菌后1.5 h進行治療，結果認為四環素在創傷弧菌感染小鼠模型體內治療中有較好的療效[11]。盡管如此，在抗生素應用治療等方面仍然值得更深入研究。傳統上抗菌藥物給藥方案的確定主要依賴于藥物 MIC、MBC 及藥物在機體內的藥代動力學參數，故傳統給藥方案要求機體內藥物濃度維持在 MIC 以上才有治療意義，當藥物濃度低于MIC 時，應再次給藥。

表3金霉素對創傷弧菌的抗菌效果

表4四環素對創傷弧菌的抗菌效果

表53種四環素類抗生素對創傷弧菌的MIC、MBC比較

3.2 抗生素對水產養殖中主要致病菌的抗菌效果

本試驗測定3種抗菌藥物的MIC和MBC，通過測定MIC和MBC了解這3種四環素類藥物的抗菌效果。MIC是抑制細菌生長所需藥物的最低濃度，試驗細菌未見生長的最低藥物濃度就為MIC，通常來表示試驗中某種抗菌藥物抑制50%和90%受試菌株生長所需的MIC。同一細菌對不同藥物的敏感性用MIC衡量，其值越小，說明越敏感，其抗菌效果越強。最低殺菌濃度最初是為了驗證四環素類藥物對創傷弧菌的抗菌作用，菌數減少99.9%或以上所需要的最低抗菌藥物的濃度，通常表示試驗中某種受試菌株50%或90%能被抗菌藥物殺滅。本試驗就是通過檢測出鹽酸土霉素、四環素和金霉素的MIC和MBC來驗證其對創傷弧菌的抗菌效果，以了解這3種藥物的藥理藥效。

四環素類抗生素療效顯著，應用廣泛，本試驗中筆者就選用了四環素類抗生素藥物鹽酸土霉素、金霉素和四環素，它們具有比較廣的抗菌譜，對魚類的多種致病菌也顯示出具有比較強的抗菌作用。與相關學者做的用抗生素測定創傷弧菌感染小鼠的試驗[11]不同的是，本試驗直接選取了分離提純后的創傷弧菌在培養基擴增后的細菌來作為試驗的對象。除了陰性對照和陽性對照外，又將不同濃度的四環素類抗生素加入了相同體積細菌的培養基試管中，12 h之后進行比較觀察。根據靳恒等發表的5種中草藥和9種抗生素對養殖鰻鱺主要致病菌的抑制作用四環素類的抗生素對鰻鱺致病菌的抗菌效果，MIC和MBC均大于1 000 μg/mL[12]。而本試驗所得數據結果顯示，鹽酸土霉素MBC為3 200 μg/mL，MIC為51.2～2 560 μg/mL；金霉素MBC為1 920 μg/mL，MIC為51.2～1 280 μg/mL；四環素MBC為2 560 μg/mL，MIC為51.2～1 920 μg/mL，與靳恒等的試驗結果[12]相一致，但是也存在些許的不同，由于本試驗運用的試驗菌株為創傷弧菌，而其運用的鰻鱺的致病菌可能會給試驗結果帶來不同，源于試驗檢測觀察的時間不同，時間越長可能會造成部分菌株的衰敗，不能保證其活性，所以相對用藥濃度可能會減少，本試驗用于藥物和細菌培養的時間是12 h，能夠充分保證細菌活性。用藥也會相對增多，試驗器材和人員的操作同時也會產生一些誤差。四環素類抗生素的作用效果顯著，但鹽酸土霉素、金霉素、四環素對創傷弧菌的抗菌效果存在些差異，本試驗探究3種四環素類藥物對創傷弧菌的效果可知，金霉素>四環素>鹽酸土霉素。

4 結論

本試驗中的3種抗菌藥中，創傷弧菌對金霉素最敏感，最小抑菌濃度為51.2～1 280 mg/L，最小殺菌濃度為 1 920 mg/L；其次是四環素，其最小抑菌濃度為51.2～1 920 mg/L，最小殺菌濃度為2 560 mg/L，最后是鹽酸土霉素，其最小抑菌濃度為51.2～2 560 mg/L，最小殺菌濃度 3 200 mg/L。金霉素對于創傷弧菌最敏感，效果最顯著，四環素為中等，鹽酸土霉素對創傷弧菌的抗菌抑菌效果是三者中最弱的。適量的藥物使用是水產養殖中不容忽視的關鍵因子之一。不合理的藥物使用往往會導致水產動物過早地產生抗藥性。因此，在治療海水創傷弧菌感染時，藥物的選擇必須慎重，切勿濫用抗菌藥物。掌握好藥物的劑量、合理地使用抗菌藥，不僅可以有效地利用藥物，還可以降低細菌對藥物的抗藥性。所以在藥物使用過程中，針對不同藥物要控制好劑量，這樣才能對疾病的防治有更好的效果。

參考文獻：

[1]田 丁，林天龍，許斌福. 創傷弧菌、溶藻弧菌外膜蛋白特性的比較研究[J]. 水產科學，2011，30(1)：27-30.

[2]邰義萍，莫測輝，李彥文，等. 東莞市蔬菜基地土壤中四環素類抗生素的含量與分布[J]. 中國環境科學，2011，31(1)：90-95.

[3]邰義萍，莫測輝，李彥文，等. 長期施用糞肥土壤中喹諾酮類抗生素的含量與分布特征[J]. 中國環境科學，2010，30(6)：816-821.

[4]鮑艷宇，周啟星，萬 瑩，等. 3種四環素類抗生素在褐土上的吸附和解吸[J]. 中國環境科學，2010，30(10)：1383-1388.

[5]Kabir J，Umoh V J，Audu-Okoh E，et al. Veterinary drug use in poultry farms and determination of antimicrobial drug residues in commercial eggs and slaughtered chicken in Kaduna State，Nigeria[J]. Food Control，2004，15(2)：99-105.

[6]Weiss C，Conte A，Milandri C，et al. Veterinary drugs residue monitoring in Italian poultry：current strategies and possible developments[J]. Food Control，2007，18(9)：1068-1076.

[7]Farombi E O，Ugwuezunmba M C，Ezenwadu T T，et al. Tetracycline-induced reproductivetoxicity in male rats：effects of vitamin C andN-acetylcysteine[J]. Experimental and Toxicologic Pathology，2008，60(1)：77-85.

[8]Seligy V V，Rancourt J. Antibiotic MIC/MBC analysis ofBacillus-based commercial insecticides：use of bioreduction and DNA-based assays[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，1999，22(6)：565-574.

[9]陳昌福，張松柏. 三畝靈與鹽酸土霉素結合使用對黃鱔細菌性疾病的防治效果[J]. 漁業致富指南，2004(6)：62-64.

[10]盧才教，盧中秋，魏 群，等. 救治創傷弧菌性膿毒癥五例[J]. 中華燒傷雜志，2005，21(2)：139.

[11]盧中秋，胡國新，周鐵麗，等. 創傷弧菌感染小鼠抗菌藥物的實驗治療[J]. 四川生理科學雜志，2003，25(1)：34-37.

[12]靳 恒，李忠琴，羅鳴鐘，等. 5種中草藥和9種抗生素對養殖鰻鱺主要致病菌的抑制作用[J]. 安徽農業科學，2012，40(32)：15737-15740.