黃顙魚病原嗜水氣單胞菌分離鑒定及致病性研究

柏愛旭， 張 科， 張敬友， 童明龍， 段宏安

(1.淮安出入境檢驗檢疫局，江蘇淮安 223001； 2.宜興出入境檢驗檢疫局，江蘇無錫 214200；3.連云港出入境檢驗檢疫局，江蘇連云港 222000)

黃顙魚(PesudobagrusfulvidracoRichardson)，別稱黃臘丁、黃骨魚，在魚類分類學中屬鲇形目(Siluriformes)科(Bagridae)，主要分布在東亞國家。黃顙魚在我國分布廣泛，在各大水系均有分布，特別在長江中下游的湖北、安徽、江蘇更為集中[1]，是一種營養價值和藥用價值都較高的優質淡水魚類，也是出口創匯的優良品種。隨著市場需求的增大，黃顙魚的人工養殖在全國各地興起。過去的幾十年中，以繁育技術、養殖工藝以及飼料營養等為主的養殖技術也迅速發展。養殖技術的發展降低了養殖成本，創造了更多的經濟效益。

但是由于養殖密度的增加、養殖環境惡化，加之對于傳染性疾病防控的重視度不夠，黃顙魚出現了各種疾病，如病毒病、細菌病和寄生蟲病，導致產生嚴重的經濟損失。目前，許多中國學者對黃顙魚的紅頭病[2-4]、腹水病[5-6]、敗血癥病以及水霉病[7-8]等進行了報道。除此之外，腸道出血病也是困擾黃顙魚養殖業的一大問題，但是目前對于黃顙魚腸道出血病病原的報道較少。

2015年6月江蘇淮安某黃顙魚養殖場的黃顙魚出現大量死亡，病魚主要癥狀為腹部腫大，腸道充血，并且部分瀕死魚腹腔內有淡黃色黏稠積液。為查明該病病因，經細菌性病原的分離和鑒定，取患病魚的腸道和積液分離優勢菌，最終確定病原為氣單胞菌屬(Aeromonas)。氣單胞菌屬普遍存在于自然環境中，經常從人體、魚體、兩棲類以及人的食物中分離到。氣單胞菌屬為條件性致病菌，在密度過大、水體污染以及缺氧等惡劣環境下，能導致多種魚類發病和死亡。國內外學者報道了嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)、溫和氣單胞菌(A.sobria)以及維氏氣單胞菌屬(A.veronii)等菌屬引起魚類產生嚴重疾病[9-17]。本研究從患病養殖黃顙魚腸道和腹水中分離出2株優勢致病菌(JSHA-01與JSHA-02)，采用16S rDNA序列測定和系統發育分析的方法對2株菌進行分類鑒定。嗜水氣單胞菌自20世紀80年代以來在多種淡水魚類上分離到，造成了巨大的經濟損失。通過對病魚的病理切片觀察以及病原菌的回感試驗，可分析該病原菌對黃顙魚致病的病理特征。在此基礎上，進行藥物敏感性試驗，為養殖生產中有效防治該病提供依據。

1 材料與方法

1.1 病料樣品、試驗魚及主要試劑

病黃顙魚樣品取自江蘇淮安某養殖場；回感試驗在中國水產科學研究院淡水漁業研究中心進行，健康黃顙魚購自江蘇無錫某養殖場，體長15～20 cm，體質量(60±5) g，暫養于實驗室玻璃水缸中。藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠純化試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司(簡稱上海生工)。

1.2 細菌的分離純化

患病黃顙魚用滅菌生理鹽水沖洗2～3次，用經過70%乙醇滅菌消毒的解剖工具解剖，取新鮮病灶組織(腸組織以及腸道液)，滴加少許滅菌生理鹽水，在經過滅菌的研磨器中進行組織勻漿，平板劃線法接種于LB平板培養基上，37 ℃培養18 h后，選取單個、優勢菌落劃線純化培養。

1.3 細菌16S rRNA分子鑒定

用上海生工的細菌基因組DNA抽提試劑盒抽提上述2株菌基因組DNA。在氣單胞菌屬16S rRNA保守區域設計引物擴增16S rDNA序列。

正向引物：5′-GAGGTAATGGCTCACCAAGGC-3′；反向引物：5′-CGCTCGTTGCGGGACTTA-3′。PCR反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，54 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，30個循環；68 ℃ 10 min。擴增產物進行膠回收，并將其克隆到全式金pEASY-Blunt Simple克隆載體上，然后送至上海生工測序，用MEGA5軟件采用鄰接法構建系統發育樹進行同源性分析。

1.4 人工感染試驗

將分離得到的JSHA-01接種于LB液體培養基中，37 ℃培養16 h，離心菌體然后用滅菌生理鹽水分別稀釋至 5×108、5×106、5×104CFU/mL。將暫養1周的健康黃顙魚隨機分組，每個梯度的菌懸液接種10尾魚，每尾接種 0.2 mL；對照組黃顙魚注射等量滅菌生理鹽水，記錄發病與死亡情況，同時對接種后的發病魚的腸道及腹腔積液進行細菌再分離純化培養。對剛剛死亡病魚進行解剖觀察，并固定腸道組織用于病理切片。

1.5 藥物敏感試驗

按照常規紙片法對經過鑒定的菌株進行16種常用抗生素耐藥性檢測。將JSHA-01接種于LB液體培養基中，37 ℃培養16 h，離心菌體，然后用滅菌生理鹽水重懸，制成濃度約為108CFU/mL的菌懸液。取0.1 mL菌懸液涂布于平板培養基上，將藥敏紙片貼于該平板上，37 ℃培養24 h，測量抗生素抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離

從腸組織和腹水中1共分離到5株優勢菌，筆者選取其中2株進行后續試驗。其菌落直徑為0.5 mm左右、邊緣整齊、圓形，表面光滑、中央凸起、灰白色、不透明。同時用30%甘油保存至-80 ℃冰箱。

2.2 16S rRNA基因同源性分析

JSHA-01與JSHA-02的16S rRNA基因序列長度分別為1 450、1 452 bp，通過NCBI檢索系統(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行序列同源性分析。圖1結果顯示，這2株菌屬于嗜水氣單胞菌。

2.3 分離菌的致病性

由表1可知，健康黃顙魚在接種不同梯度的病原菌菌液后死亡情況不一，病原菌濃度達到5×104CFU/mL時，死亡率在40%～50%，病原菌濃度達到5×108CFU/mL時，死亡率在90%～100%，而對照組在試驗觀察期內未見死亡。死亡黃顙魚體表正常，解剖發現腸道充血發紅，腹腔內有少量黃色積液，與最初分離病原的病魚癥狀類似。取腸道組織及腹腔積液進行細菌分離，經鑒定分離到的病原菌為原菌株。該病原主要引起黃顙魚腸組織病變，觀察腸組織切片(圖2)可知，感染魚腸絨毛變短變少，腸絨毛頂端開始出現“溶解”，有的開始出現脫落。

表1JSHA-01和JSHA-02對健康黃顙魚的感染試驗

2.4 藥敏試驗

采用16種常用抗生素對致病菌進行耐藥性試驗，由表2可知，分離菌JSHA-01對供試的復方新諾明、氯霉素、依諾沙星等6種抗生素敏感，對紅霉素、新霉素、氨芐西林等7種抗生素敏感中介，對新生霉素、青霉素、鏈霉素等3種藥物耐藥；分離菌JSHA-02對供試的頭孢曲松、依諾沙星、恩諾沙星等6種藥物敏感，對紅霉素、諾氟沙星、頭孢他啶等7種藥物中介，對復方新諾明、青霉素、鏈霉素等3種藥物耐藥。

表2JSHA-01和JSHA-02的藥物敏感試驗結果

3 討論

嗜水氣單胞菌屬普遍存在于自然環境中，經常從人體、魚體、兩棲類以及人的食物中分離到。氣單胞菌屬是一種條件性致病菌，存在于黃顙魚以及其他魚類腸道與水體中[11，21-22]。魚腸道中微生物是一把雙刃劍，當宿主利用各種防御機制將細菌的種類和數量控制在一定水平時，腸道微生物與宿主相互作用，但是當這一平衡被打破時，往往能導致宿主疾病暴發。養殖環境惡化以及養殖生物自身免疫系統紊亂時，嗜水氣單胞菌大量繁殖，從而導致微生態的不平衡，這是細菌性疾病暴發的根源。徐伯亥等的研究證實氣單胞菌大量繁殖與腸機能的紊亂有關，從而導致疾病發生[23-24]。因而從生產上建議，養殖者應該適當嚴格做好清塘工作、控制放養密度，保持良好水質，提升黃顙魚養殖的生態環境。

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