凡納濱對蝦P53親水肽段原核表達及抗體制備

劉 歡， 黃明珠， 陳曉燕， 房春娟， 姜雯雯， 朱芳芳， 熊志偉

(江西科技學院護理學院，江西南昌 330098)

凡納濱對蝦(別稱南美白對蝦)是當今世界水產養殖業產量最高的三大蝦類之一。隨著養殖規模的擴大，對蝦病害已經成為制約該產業發展的重要障礙。凡納濱對蝦為較低等的水生節肢動物，其生理特征表現為對病害的易感性。生長、發育的生命周期較短，各器官和系統形成迅速、構造簡單，較高的新陳代謝水平和較低等的器官結構使得凡納濱對蝦對病原體抵抗能力較弱。凡納濱對蝦的鰓直接與水體接觸，在進行呼吸和排泄時，各種外界惡劣的環境條件直接接觸鰓結構，因此病原體較易感染或通過鰓部而影響全身。凡納濱對蝦的生命周期中有蛻殼的生理特點，蛻殼前凡納濱對蝦停止進食，蛻殼之后蝦體又非常脆弱，在此期間蝦體的防御能力減弱，對病原體和敵害的抵抗力極差，因而極易被病原體感染[1]。隨著養殖水域受到嚴重污染，水質的富營養化，水體的酸堿化，重金屬污染等都是目前非常嚴重的問題[2]，養殖強度的擴大和養殖環境惡化將給對蝦病害的控制帶來更大的挑戰。

機體在對抗病害、重金屬、環境等因素脅迫時，會導致負氧離子等活性氧(ROS)的產生[3-4]，高濃度的氧化自由基會導致細胞損傷甚至細胞死亡[5]。P53與DNA的完整性、細胞周期、呼吸暴發都有密切聯系[6-7]。亞硝酸鹽應激誘導對蝦血細胞產生了過量的NO和ROS，造成氧化脅迫作用，誘導凋亡P53基因的表達[8]。在重金屬和低pH值環境的應激下，凡納濱對蝦P53基因表達與LvMnSOD和LvGPx有著密切的聯系[9]。十足目的P53對損傷的DNA進行修復以保證正常的精子發生，或引發凋亡以去除不正常的精細胞[10]。本研究通過分析凡納濱對蝦P53序列親水性，利用原核表達獲得親水肽段，免疫大白兔獲得多克隆抗體，探索出1條簡單高效地獲得P53多克隆抗體的途徑，為P53的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 大腸桿菌EscherichiacoliDH5α、E.coliBL21菌株，原核表達載體pet32a，PMD-18T載體，購自TaKaRa公司。

1.1.2 試劑 弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑，為Sigma公司產品；NC膜為Pall Life Science公司產品；Ni NTA填料，Trizol試劑，購自Invitrogen公司；酵母浸出膏、胰蛋白胨、蛋白胨，為MD Bioscience公司產品；DNA凝膠回收試劑盒、限制性內切酶、質粒小提試劑盒，為Axygen產品；反轉錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit、T4DNA連接酶，為TaKaRa公司產品；預染低分子量蛋白Marker，為BIO-RAD公司產品；動物蛋白提取試劑盒，為生工生物工程(上海)股份有限公司產品；堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG，為北京鼎國生物科技有限公司產品。其余產品為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 從GenBank獲得凡納濱對蝦P53基因序列(ANN87874.1)，通過在線網站(http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input)預測P53親水肽段，根據親水肽段編碼序列設計特異性引物，即上游引物P53s：5′-GCGAATTCATGCGTCACAAATTCGGCATCTCCCTC C-3′，下游引物P53x：5′-GCTCTAGATTAATGATGATGATG ATGATGGCAC TTGCAGCACTTAATGTCCAG-3′(包含酶切位點、終止密碼子、6×His標簽)擴增P53親水肽段。引物由深圳華大基因合成。

1.2.2 凡納濱對蝦肝胰腺RNA提取和cDNA的合成 取肝胰腺，液氮冷凍研磨，按說明書Trizol法提取總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA。

1.2.3 擴增目的基因 以“1.2.2”節步驟中合成的cDNA為模板，利用設計的特異性引物進行PCR擴增，程序為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環；72 ℃ 4 min，4 ℃保存。PCR產物通過1%瓊脂糖膠電泳檢測，紫外燈下切膠后，用DNA凝膠回收試劑盒回收。

1.2.4 鑒定目的片段 將“1.2.3”節步驟回收的DNA片段與PMD-18T載體連接后，轉化大腸桿菌DH5a，轉化后涂氨芐青霉素(Amp)固體平板，37 ℃培養過夜，挑陽性克隆進行菌液PCR，測序。測序正確的載體命名為PMD-18T-P53。

1.2.5 表達載體構建 用限制性內切酶EcoRⅠ和XbaⅠ對PMD-18T-P53和pet32a載體分別進行雙酶切，酶切產物跑1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切膠，通過DNA凝膠回收試劑盒回收，回收產物按物質的量比1 ∶5混合，按比例加入T4 DNA連接酶，4 ℃過夜，轉化DH5α，轉化后涂平板，37 ℃過夜培養，挑陽性克隆進行菌液PCR檢測，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序正確的載體命名為pet32a-P53。

1.2.6 融合蛋白誘導 將構建的重組表達質粒轉化進BL21，轉化后涂平板，37 ℃培養過夜，挑陽性克隆進行菌液PCR驗證。驗證正確的菌株接種于含100 mmol/L Amp的LB液體培養基中，180 r/min、37 ℃培養至D600 nm為0.4～0.6，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside，簡稱IPTG)，使之終濃度為1 mmol/L，誘導3 h后，每隔1 h取樣，跑十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE)蛋白膠檢測蛋白表達情況。

1.2.7 發酵產物純化 大量發酵后，收集菌體，用磷酸緩沖液重懸，在超聲波下破碎30 min；8 000 r/min，4 ℃，離心 15 min，棄上清；用含4 mol/L尿素的緩沖液溶解，12 000 r/min，4 ℃，離心20 min，留上清，0.4 μm濾膜過濾；依照Ni-NAT操作手冊進行蛋白純化，跑SDS-PAG蛋白膠檢測蛋白純化情況。

1.2.8 抗體制備 重組蛋白溶液(含0.5～1.0 mg重組蛋白)加等體積弗氏完全佐劑，用注射器混勻，分多點注射于大白兔腹部及腹股溝，每隔7 d免疫1次，免疫4次后，收集血清。

2 結果與分析

2.1 目的片段擴增

由圖1、圖2可知，通過在線網站預測P53親水肽段，以編碼親水肽段cDNA為模板擴增目的片段，瓊脂糖凝膠電泳驗證表明，在500 bp左右有亮帶，與預期大小相符，經測序證實確為P53序列。

2.2 表達載體構建

分別雙酶切載體和目的基因后，連接酶切后所需片段，轉化大腸桿菌BL21，擴大培養后，提取質粒，對質粒進行雙酶切驗證。由圖3可知，電泳后有2條條帶，較大的為開環pet32a，較小 500 bp 左右的片段為目的片段，證實表達載體構建成功。

2.3 融合蛋白誘導表達及純化

將構建好的原核表達菌株經IPTG誘導后，經SDS-PAGE蛋白膠檢測，以加入IPTG之前菌體為對照，由圖4可知，誘導后的菌體在18 ku左右有明顯差異條帶，符合預期大小；由圖5可知，通過鎳(Ni)柱純化后得到較單一條帶。

2.4 抗體制備檢測

純化蛋白免疫新西蘭白兔后，取血清，用抗體稀釋液與肝胰腺總蛋白進行Western blot，結果見圖6。

3 討論

由于LvP53 ORF有超過1.5 kb的DNA序列，編碼蛋白分子量過大，不易表達，所以選擇其中一段含有多個親水位點的(即含多個抗原表位)序列。原核表達方法成熟且表達量大，通過原核表達獲得高拷貝數的免疫活性的P53抗原。在PCR獲得目的片段和連接酶切位點時，一般方法必須經過2次PCR。在本研究中，直接連上酶切位點和HIS標簽，引物設計超過20 bp，下游引物達到53 bp，1次PCR，一步到位，節約了時間和試劑。不足的是PCR產物中有大量的引物二聚體，通過切膠回收目的條帶，也能滿足做下一步研究的需求。

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