侗族傳統腌魚中乳酸菌的分離鑒定與生物學特性

杜 斌， 吳文能， 王繼玥， 周笑犁， 余 旭

(貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽 550005)

貴州黔東南苗族、侗族自治州的傳統民族食品腌魚，主要是以稻田養殖的鯉魚為原料，將鯉魚由背部剖開并除去內臟，鹽腌16～24 h后，拌入糯米飯、辣椒粉及其他輔助香料入壇(桶)，放置于避光陰涼的地方自然發酵而成。腌魚集甜、酸、辣、麻、咸于一體，口感軟嫩，味道鮮美，可生吃，亦可煎、炸、烤、蒸，是當地民眾招待客人的上乘佳肴[1-2]。但是由于傳統手工工藝制作過程復雜，發酵時間較長，目前腌魚還沒有大規模生產和上市流通。乳酸菌作為傳統發酵肉制品中的優勢菌群，對產品風味的形成和營養品質變化起著至關重要的作用。目前對于少數民族傳統發酵肉制品中乳酸菌的研究還比較缺乏，為此，本研究以侗族傳統民族食品腌魚為材料，對成品中的乳酸菌進行分離鑒定，并利用16S rRNA序列分析方法進行菌種鑒定，以期發現腌魚中特有的菌種資源，為改進其傳統工藝，進而發掘有益乳酸菌打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料 本試驗用稻田鯉魚捕捉于貴州省黔東南州黎平縣，采用當地農戶傳統腌制方法腌制60d制成成品，另外收集當地農戶的腌魚成品，共3份樣品。采樣時嚴格按照GB/T4789.1—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗總則》操作。腌魚樣品分別編號為ZZY、CJY-1、CJY-2(ZZY為自制腌魚，CJY-1、CJY-2為采集樣品)。

1.1.2 培養基及主要試劑 MRS肉湯培養基，購自北京奧博星生物技術有限公司；PCR相關試劑，均購自北京全式金生物技術有限公司；微量生化鑒定管，購自青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；電熱恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司；2720 Thermal Cycler PCR儀，Applied Biosystems；DYY-5型電泳儀，北京市六一儀器廠；FR980凝膠成像儀，上海復日科技儀器有限公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株分離純化 取3 g樣品，剪碎后放入MRS液體培養基中，37 ℃恒溫厭氧培養48 h后，對培養液進行10倍梯度稀釋，取200 μL 104～107倍稀釋液于含有2% CaCO3的MRS固體培養基中，37 ℃培養48 h，挑取有溶鈣圈的單菌落接種于MRS固體培養基中，進行多次劃線分離，挑選革蘭氏陽性(G+)、過氧化氫酶陰性(H2O2-)的單菌落并進行保藏。

1.3.2 生理生化鑒定 參考《一般細菌常用鑒定方法》[3]，對分離純化的乳酸菌進行生理生化鑒定。

1.3.3 16S rDNA分析

1.3.3.1 16S rDNA基因序列PCR擴增 取單菌落置于離心管中，加入20 μL無菌蒸餾水重懸，沸水浴10 min，12 000 r/min 離心5 min。上清中即含16S rDNA基因。采用細菌通用引物16S rDNA-F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，16S rDNA-R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCG CA-3′，以基因組DNA為模板PCR擴增16S rDNA基因。

25 μL反應體系：1 μL模板DNA，各2.5 μL引物(1 μmol/L)，12.5 μL 2×EasyTaqPCR SuperMix，6.5 μL去離子水。反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，25個循環；72 ℃ 2 min。用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.3.3.2 菌株同源性分析及系統發育樹的構建 將菌株序列在GenBank數據庫中進行Blast同源性比對分析，運用MEGA 7.0軟件的相鄰計算法構建系統發育樹，判斷目的菌株的分類地位。

1.3.4 菌株生長能力和產酸能力測定 將待測菌株接種于MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，以未接種菌液的MRS培養基作為空白對照，每隔2 h取200 μL培養液，采用酶標儀測定其D600 nm及培養液pH值。每個樣平行測定3次。

1.3.5 溫度對菌株生長的影響 將分離菌株接種于MRS液體培養基中，分別于15、20、30、37、45、50 ℃條件下培養24 h，以未接種菌液的培養基作為空白對照，D600 nm的測定方法同“1.3.4”節，研究溫度對待測菌株生長代謝的影響。

1.3.6 NaCl濃度對分離菌株生長代謝的影響 將分離菌株接種于含鹽量分別為0%、2%、4%、6%、8%、10%的MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，以未接種菌液的培養基作為空白對照，D600 nm測定方法同“1.3.4”節。

1.3.7 蛋白酶活性的測定 參照文獻[4]進行，略有改動，分別以添加15%脫脂牛乳的MRS和營養瓊脂固體培養基作為測定蛋白酶活性的專用培養基。將待測菌接種于MRS液體培養基中，于37 ℃培養24 h后，無菌吸取100 μL培養液，接種于蛋白酶檢測專用培養基中，涂布均勻，于37 ℃培養 24 h，若菌落周圍有透明環，則為陽性。

1.3.8 脂肪酶活性的測定 參照文獻[5]進行，略有改動，分別以添加15%牛油、0.5%中性紅指示劑的MRS和營養瓊脂固體培養基作為測定脂肪酶活性的專用培養基。將待測菌株接種于MRS液體培養基中，于37 ℃培養24 h后，無菌吸取 100 μL 培養液，接種于脂肪酶檢測專用培養基中，涂布均勻，于37 ℃培養24 h，若培養基上出現紅色斑點，則為陽性。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

本試驗采用MRS選擇性培養基，對3個樣品中的優勢乳酸菌群進行分離及純化。經顯微觀察菌落形態、革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗，得到G+和H2O2-菌株共16株，初步鑒定均為乳酸菌。其中從樣品ZZY中分離得到7株，從CJY-1中分離得到6株，從CJY-2中分離得到3株。所獲菌株的菌落形態多為邊緣整齊、表面光滑或稍粗糙，MRS培養基中的菌落呈乳白色或淺黃色凸起的圓形。鏡檢觀察全部為桿狀或短桿狀，成單、對或堆排列。

2.2 生理生化鑒定

對上述16株乳酸菌進一步進行生理生化鑒定試驗，結果見表1。可以看出，所有乳酸菌產酸，不可水解明膠和淀粉；查閱《一般細菌常用鑒定方法》《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[3，6]，初步確定乳酸菌主要為消化乳桿菌(8株)、植物乳桿菌(4株)、草乳桿菌(2株)和發酵乳桿菌(2株)。可以看出，消化乳桿菌為侗族傳統腌魚產品中的優勢乳酸菌之一，從菌株數量來看較多。該結果與鹽干帶魚微生物區系研究較為相似[7]，但與其他傳統肉制品的微生物區系研究具有較大的差異，如干腌牛肉(Cecina de Leon)以及云南干腌火腿中乳酸菌屬細菌以植物乳桿菌、發酵乳桿菌為優勢菌[8]，這可能是由加工原料及加工工藝的不同造成的。

2.3 16S rDNA分析

根據生化鑒定結果，分別對菌株ZZY-6、CJY1-1、ZZY-3 和CJY2-3進行16S rDNA分子生物學鑒定，將PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳進行分析，如圖1所示，4株待測菌條帶明亮清晰，且無明顯拖尾，均在1 500 bp附近，可以進行序列檢測。

2.4 測序結果分析

將PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析，通過BLAST，將所測定的菌株序列結果與GenBank數據庫中已知菌株序列進行比對，尋找與目的基因序列同源性最高的已分類的菌種，然后用軟件MEGA 6進行序列分析，構建系統發育樹。如圖2所示，所分離菌株ZZY-6、CJY1-1、ZZY-3和CJY2-3的遺傳進化分別與已知消化乳桿菌(LactobacillusalimentariusW369、L.alimentariusIMAU80036)、已知植物乳桿菌(L.plantarumNi344、L.plantarumWCFS1)、已知草乳桿菌(L.graminisLMG 9825)和已知發酵乳桿菌(L.fermentumKFC、L.fermentumM17-1)同處于一個分支，同源性高達99%。這一結果與生化鑒定結果完全一致。

2.5 菌株生長特性

2.5.1 生長曲線的測定 對菌株ZZY-6、CJY1-1、ZZY-3和CJY2-3進行生長曲線研究。由圖3可知，4株乳酸菌中只有草乳桿菌ZZY-3在培養6 h后進入生長對數期，18 h后才趨于平緩生長，而其他4株菌均表現出相似的生長特性，在4 h 后進入對數生長期，14 h后達到穩定生長期，比較D600 nm可知，消化乳桿菌ZZY-6、植物乳桿菌CJY1-1和發酵乳桿菌CJY2-3的生長速率要高于草乳桿菌ZZY-3，更早到達平臺期。

表1分離菌株的生理生化鑒定

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性，“±”表示11%～89%的菌株為陽性。表2同。

2.5.2 產酸性能的測定 圖4表明，ZZY-6、CJY1-1、ZZY-3 和CJY2-3等4株待測菌株均有較好的產酸能力，培養 4 h 后，菌株ZZY-6、CJY1-1和CJY2-3發酵液的pH值均快速下降。培養14 h后，這3株菌培養pH值均下降到4.0左右。而菌株ZZY-3培養16 h后發酵液pH值才降到4.0，這與菌株生長情況基本是對應的。結果表明，分離菌株符合發酵肉制品發酵劑的要求，可快速使環境 pH值下降，因此能抑制腐敗菌的生長[9]，提高產品的安全性。

2.5.3 發酵溫度對分離菌株生長代謝的影響 溫度對于菌株生長及產酸影響較大，由圖5可知，環境溫度在15～37 ℃范圍內時，分離菌株的D600 nm逐漸升高，當溫度高于40 ℃時，其D600 nm開始下降；當溫度繼續升高，菌株的生長受到極大抑制，因此分離菌株最適發酵溫度為37 ℃。

2.5.4 NaCl濃度對生長的影響 傳統腌魚腌制時通常要加入一定量的NaCl，魚體內NaCl含量較高，而對NaCl的耐受能力是選擇發酵肉制品發酵劑的一個重要因素， 篩選出的菌株通常要求至少能夠在6%的NaCl濃度下正常生長[10]。本試驗考察了NaCl濃度對4株菌株生長的影響，如圖6所示，隨著NaCl濃度的升高，4株菌株的生長均受到不同程度的抑制，隨著NaCl濃度增大，抑制作用越強；當NaCl濃度在0～4%時，菌株受到的抑制作用較小；當NaCl濃度達到6%時，菌株生長力均有所下降但仍能生長，表明這4株菌對NaCl具有一定的耐受能力，該分離菌株在腌魚發酵過程中有較強競爭力，可作為相關肉制品的備選發酵劑。

2.5.5 蛋白酶活性與脂肪酶活性測定 乳酸菌蛋白酶活性與脂肪酶活性，是篩選性質優良、穩定性強的工業生產菌株的主要指標[11-13]。本研究初步分析了4個菌株的相應酶活性。由表2可知，只有植物乳桿菌CJY1-1具有蛋白酶活性，而其余3株菌株均未檢測到蛋白酶活性；這4株菌株脂肪酶的檢測結果均為陰性，表明分離得到的菌株均不具有脂肪酶活性。

表2分離菌株的蛋白酶活性和脂肪酶活性

3 結論

由于地域不同以及制作工藝的差異，侗族傳統腌魚中優勢乳酸菌群也略有不同。本研究從3份樣品中共分離出16株乳酸菌。經生理生化鑒定，初步確定乳酸菌主要為消化乳桿菌(8株)、植物乳桿菌(4株)、草乳桿菌(2株)和發酵乳桿菌(2株)，分別選取1株菌株，通過16S rDNA測序分析進行進一步確認。對分離菌株的生長特性進行研究發現，所得菌株均具有較好的生長能力和產酸性能，并且表現出較高的耐鹽能力，而且檢測到植物乳桿菌CJY1-1具有一定的蛋白酶活性，這些研究數據為了解侗族傳統腌魚中的乳酸菌群、揭示其發酵機制，以及工業化實行純菌種生產的腌魚產品提供了菌種支持，并為發掘侗族傳統腌魚中的益生乳酸菌打下了基礎。

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