橙皮苷（C28H34O15）改善自發性糖尿病小鼠腎損傷炎癥機制的研究＊

竇永會，徐思源，蘭 天，榮向路，郭 姣

（廣州中醫藥大學 廣州 510006）

糖尿病腎病是糖尿病常見并發癥之一。高血糖是糖尿病腎病的高危因素，長期慢性的高血糖狀態會引發腎臟發生結構及功能改變[1,2]。大量實驗研究與臨床觀察表明，血流動力學改變和代謝通路功能失調導致人體自身的免疫系統功能下降，并進一步引發慢性炎癥。慢性炎癥反應通過細胞因子、生長因子以及腎臟固有細胞的共同作用參與糖尿病腎臟病的發生發展過程[2,3]。前期實驗研究表明，單核/巨噬細胞在糖尿病腎病炎癥反應早期具有重要作用，炎癥細胞浸潤是糖尿病腎病早期發生與后期進展的重要病理特征[4]。

橙皮苷是從橙皮中提取的一類化合物，在維持患者的滲透壓、增強毛細血管的韌性、降低膽固醇及對糖尿病和心腦血管的輔助治療方面具有很好的療效[5]。橙皮苷的藥理研究表明，其具有良好的抗氧化、抗炎作用[6]，能改善高脂血癥大鼠血脂代謝紊亂等功效[7]。陳明喆等[8]研究發現橙皮苷能明顯降低IgA腎病大鼠24 h尿蛋白，減少尿紅細胞計數，具有腎臟保護功能。袁廷東等[9]發現橙皮苷能通過抑制TNF-α和IFN-?的表達對急性肝損傷小鼠起到肝臟保護作用。橙皮苷的相關研究還發現給予高脂血癥模型大鼠橙皮苷后，能顯著調節模型大鼠的血脂水平及血液黏滯狀態，對防治高脂血癥具有積極作用[10]。蒲鵬[11]研究發現橙皮苷具有減肥，改善高血糖、高血脂，緩解胰島素抵抗的藥效。

當前，針對于橙皮苷的藥效研究多集中在肝臟保護方面，對糖尿病引起的腎損傷研究較少，且機制不明確。本研究通過探討橙皮苷對db/db自發性糖尿病小鼠模型腎損傷的保護作用的研究，對橙皮苷改善糖尿病腎損傷的藥效及機制進行初期研究。

表1 引物序列

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑

橙皮苷（分子式：C28H34O15，分子量：610.57，質量標準：HPLC≥98%，標準品。美侖生物技術有限公司，5 g，N0908A）；葡萄糖測定試劑盒（上海榮盛生物藥業有限公司，201604012147）；肌酐試劑盒（南京建成生物工程研究所，96 T，20160320）；尿蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所，100 T/96樣，20160812）；糖原染色劑（Leagene，4×100 mL，03151217）；F4/80一抗（Cell Signaling Technology，ab74382）。

1.1.2 實驗動物與給藥

SPF級24周齡db/m與db/db雄性小鼠由廣東藥科大學動物中心繁殖所得，SPF級環境下給予普通飼料，自由飲水喂養（溫度22±1℃，濕度55±5%，12 h光暗循環；飼料和水均在消毒后由動物自由攝?。?。選取相同周齡雄性db/m小鼠為對照組，禁食12 h后血糖值大于7.0 mmol·L-1的db/db小鼠作為實驗動物。根據血糖值和體重將db/db小鼠隨機分為模型組與給藥組，每組10只，予以普通飼料喂養，橙皮苷（200 mg·kg-1B.W.）灌胃給藥，連續14周，對照組與模型組給予相同劑量的溶媒（0.5%CMC-Na）。所有動物實驗內容均嚴格按照國家和廣東藥科大學動物中心動物使用管理條例進行實驗設計和實施。

1.1.3 主要儀器

冷凍離心機（賽洛捷克公司，型號：D3024R）；酶標儀(Thermo，型號：1510)；石蠟切片機（Thermo，型號：HM340E）；冰切機（Thermo，型號：NX50）；正置熒光顯微鏡（OLYMPUS，型號：BX50）；熒光-PCR儀（BIORAD，型號：788BR04969）

1.2 實驗方法

1.2.1 觀察指標與方法

實驗動物給藥14周后，采用提尾法收集尿液并檢測尿液中的尿白蛋白（MAIb）及尿肌酐（Ucr）濃度，以尿白蛋白比尿肌酐求得ACR。禁食12 h，乙醚麻醉，摘眼球取血，低溫離心，取上清檢測血漿血糖（Glucose）、血肌酐（Scr）濃度；小鼠行脫頸椎處死，摘取腎臟，稱重，進行凍存或者福爾馬林固定、脫水，以備后期實驗檢測。

1.2.2 組織H&E及PAS染色

腎臟組織行脫水、包埋并進行石蠟切片，石蠟切片進行H&E及PAS染色。H&E染色條件為：梯度脫蠟-蘇木素7 min-鹽酸乙醇分化-流水返藍-伊紅染30 s-脫水-透明-封片。PAS染色條件為梯度脫蠟-高碘酸滴染15 min-schiff試劑滴染5 min-流水沖洗5 min-脫水-透明-封片。顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 組織免疫熒光檢測

本實驗采用免疫熒光檢測小鼠腎臟組織中F4/80蛋白的表達。取腎臟組織冰凍切片，常溫中復溫30 min后PBS洗滌3次，每次5 min，3%雙氧水浸泡并洗滌，洗滌完成后加入F4/80蛋白一抗4℃孵育過夜、常溫孵育二抗2 h，DAPI染核，熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察蛋白表達情況并拍照。

1.2.4 RT-PCR

本實驗采用RT-PCR檢測炎癥相關基因F4/80、TNF-α以及IL-6在腎臟的表達情況，引物序列見表1。腎臟組織冰上勻漿，用Trizol reagent（TAKARA，日本）試劑盒提取總RNA，逆轉錄成cDNA，進行RT-PCR實驗，按照兩步法SYBR Real-time PCR Kit（TAKARA，日本)試劑盒說明書配制反應體系；溫度循環參數為預變性98℃ 2 min，98℃ 10 s，60℃ 10 s，68℃ 30 s，39個循環進行PCR擴增反應。每個樣本設置3個復孔，取其平均值，每組3個樣本進行統計分析。

2 統計學處理

運用SPSS 13.0統計軟件分析，實驗數據結果采用均數±標準差(mean±SEM)表示，各組間差異采用單因素方差(one-way ANOVA)進行分析，Bonferroni校正的t檢驗分析兩兩數據間差異，以P＜0.05表示差異具有統計學顯著性。免疫熒光結果使用Image J軟件分析統計。

3 結果

3.1 橙皮苷對糖尿病模型小鼠的體重及進食量的影響

橙皮苷對糖尿病模型小鼠的體重及進食量無明顯作用。如圖1中結果所示，實驗過程中，空白組與模型組小鼠體重一直具有顯著差異，給藥2周開始橙皮苷雖能輕微下調db/db小鼠體重但與模型組不具有顯著差異。進食量檢測結果表明各組間不具有顯著差異。

圖1 體重與進食量檢測結果

圖2 血糖與血肌酐水平檢測結果

圖3 尿液中白蛋白，肌酐和ACR結果

3.2 橙皮苷對糖尿病模型小鼠血漿中血糖和血肌酐的影響

橙皮苷對糖尿病模型小鼠血漿中血糖和血肌酐無明顯作用。如圖2中結果所示，給藥14周后，檢測各組小鼠血漿中血糖（Glucose）、血肌酐（Scr）水平，血糖結果表明橙皮苷沒有降低db/db糖尿病模型小鼠血糖的作用（P＞0.05）。Scr結果表明db/db糖尿病模型小鼠血漿中的肌酐含量仍處于正常水平（P＞0.05）。

3.3 橙皮苷對糖尿病模型小鼠尿液中腎損傷相關指標水平的影響

圖4 腎臟H&E和PAS染色結果

圖5 腎臟IF檢測結果（100×）

如圖3中結果所示，給藥14周后，檢測各組小鼠尿液中尿白蛋白（MAIb）及尿肌酐（Ucr）含量水平，計算ACR值（尿白蛋白/尿肌酐）。實驗結果表明，db/db糖尿病模型小鼠ACR值極顯著升高（P＜0.001），橙皮苷能顯著降低db/db糖尿病模型小鼠ACR值（P＜0.05），改善腎小球過濾率。

3.4 橙皮苷對糖尿病模型小鼠早期腎損傷病理的影響

腎臟H&E染色結果顯示（40×）（圖4），與空白組比較db/db糖尿病模型小鼠腎臟腎小球及腎間質有大量的巨噬細胞浸潤、毛細血管袢皺縮甚至出現腎小球凋亡，表明db/db糖尿病模型小鼠出現明顯的腎損傷病理改變。橙皮苷給藥組小鼠腎小球整體形態完整度高，巨噬細胞浸潤狀況明顯減弱。腎臟PAS染色結果（100×）（圖4）模型組系膜細胞彌散性增生，腎小球基底膜增厚明顯及系膜基質增寬明顯。給藥組能夠改善db/db糖尿病模型小鼠上述病理改變，改善早期腎臟病變。

3.5 橙皮苷對糖尿病模型小鼠腎臟F4/80表達的影響

免疫熒光（IF）檢測腎臟F4/80陽性表達結果IF檢測腎臟F4/80陽性表達結果如圖5所示。與空白組比較，db/db糖尿病模型小鼠腎小球F4/80陽性表達顯著升高（P＜0.001），而橙皮苷能顯著降低F4/80在db/db糖尿病模型小鼠腎小球的表達（P＜0.001），減輕腎小球周圍巨噬細胞的浸潤。

3.6 橙皮苷對糖尿病模型小鼠腎臟炎癥相關基因表達的影響

本實驗通過RT-PCR檢測腎臟組織中炎癥相關基因F4/80，TNF-α，IL-6表達水平，實驗結果如圖6所示。與正常組相比，db/db糖尿病模型小鼠腎臟F4/80，TNF-α，IL-6表達均明顯升高，橙皮苷給藥14周能顯著性下調db/db糖尿病模型小鼠腎臟F4/80，TNF-α，IL-6表達水平，抑制腎臟炎癥反應。

4 討論

2013年中國糖尿病指南上明確表明，糖尿病腎病的進展主要體現在尿蛋白的增多和腎小球系膜病變的發展[12]。而高血糖引發的機體代謝失常和血流動力學改變是導致腎損傷的主要病理機制。長期的高血糖通過非酶途徑產生的晚期糖基化終末產物（AGE）的積聚，過度激活的蛋白激酶C、多元醇通路和氧化應激的加速以及血管活性物質、細胞因子的激活等因素引起腎臟固有細胞的損傷，而且以上各因素間又相互影響，共同參與糖尿病腎病的發生發展過程[13]。

圖6 腎臟F4/80，TNF-α，IL-6表達水平

既往研究報道中我們可以發現，在糖尿病的啟動、進展以及達到腎衰竭的各個階段中，都有促炎細胞因子的參與。其中，巨噬細胞的浸潤是關鍵，它導致腎小球系膜基質堆積而引起一系列病理改變[14]。F4/80是巨噬細胞的特異性抗原，是其常見的標記物。參與標記巨噬細胞的成熟和活化過程,在巨噬細胞浸潤過程中F4/80蛋白的表達會發生明顯變化[15-16]。TNF-α、IL-6是整個病理過程中兩個關鍵性因子，由巨噬細胞、單核細胞以及T細胞產生[17]，TNF-α不僅可以直接誘導正常細胞產生IL-6，還可以誘導腎臟固有細胞的損傷、凋亡，與糖尿病腎損傷的進展息息相關[18]。而IL-6與DN腎損傷進展相關的指標如腎小球內皮細胞滲透性異常、系膜細胞擴張、纖連蛋白表達增加、腎小球基底膜厚度等病理變化密切相關[19]。TNF-α、IL-6作為炎癥指標中關鍵的細胞因子，能夠促進腎小球內皮細胞分泌基質，造成基質堆積[20-22]。

本研究結果顯示，橙皮苷對db/db糖尿病模型小鼠體重、進食量以及血糖無明顯調節作用，表明橙皮苷不會影響食欲、體重且沒有降血糖作用，與既往文獻報道一致[7]，證實橙皮苷不通過控制血糖改善腎損傷。尿微量白蛋白的排泄增多是糖尿病腎損傷的標志性指標，與腎小球病變及腎損傷進展密切相關[12]。本研究顯示橙皮苷顯著改善db/db糖尿病模型小鼠腎小球濾過率，降低尿微量白蛋白排泄，改善腎臟濾過功能。同時，橙皮苷顯著改善腎小球系膜增生以及毛細血管袢皺縮至血管極的病理狀態，表明橙皮苷能通過抑制腎小球病變改善腎小球濾過率達到治療腎臟損傷的作用。免疫熒光以及PCR結果顯示橙皮苷能抑制db/db糖尿病模型小鼠腎臟巨噬細胞的浸潤，下調腎小球F4/80 mRNA表達水平以及蛋白陽性表達量，下調腎臟炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達水平，抑制腎臟炎癥反應。綜上所述，橙皮苷能通過抑制db/db糖尿病模型小鼠腎臟炎癥反應、改善腎小球病變，改善腎小球濾過率，降低尿微量白蛋白排泄，達到延緩糖尿病早期腎損傷的作用。同時，橙皮苷是否可以進一步通過抗炎改善糖尿病腎病的腎臟纖維化以及大血管病變，還需進一步研究。

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