照山白浸膏片TLC鑒別和HPLC特征圖譜研究＊

崔小麗，王志軒，邱明山，姚寶林，郭海平

（1.承德市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 承德 067000；2.承德燕峰藥業(yè)有限責(zé)任公司 承德 067000）

照山白浸膏片由7%照山白飲片細(xì)粉和93%照山白飲片經(jīng)水煮的浸膏混合制成的片劑，具有祛風(fēng)散寒、活血通絡(luò)、祛痰止咳的功效，用于婦女產(chǎn)后風(fēng)寒身痛、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、老年慢性氣管炎。標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第三冊(cè)，僅有顯微和理化鑒別，質(zhì)控指標(biāo)單一，專(zhuān)屬性差。有研究表明照山白葉中含皂苷、鞣質(zhì)、還原性物質(zhì)、多糖類(lèi)、揮發(fā)油及黃酮類(lèi)和酚酸類(lèi)等，其中黃酮類(lèi)成分有抗炎作用[1-3]。為提高產(chǎn)品質(zhì)量控制水平，本實(shí)驗(yàn)以照山白為對(duì)照藥材，金絲桃苷、槲皮素、山柰素為對(duì)照品，分別建立TLC鑒別方法和HPLC特征圖譜。

1 儀器與試藥

半自動(dòng)點(diǎn)樣儀：CAMAG LINOMAT5；薄層色譜成像儀:CAMAG TLC VISUALIZER2；高效液相色譜儀：Waters e2695；電子天平：METTLER TOLEDO AG135；甲醇、乙腈（色譜純，菲舍爾公司）；甲醇、乙醇（分析純，天津市康科德科技）；娃哈哈純凈水。對(duì)照品（中檢院）：金絲桃苷（批號(hào)111521-201507）、槲皮素（100081-201509）、山柰素（110861-201310）。照山白對(duì)照藥材：采自承德豐寧，經(jīng)鑒定為杜鵑花科植物照山白R(shí)hododendron micranthum Turcz.的干燥帶葉枝梢。照山白浸膏片為承德燕峰藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，10批次，原料為帶葉枝梢。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別方法

2.1.1 供試品溶液的制備

取本品1片，去包衣，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，加70%乙醇20 ml，超聲處理10分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?0%乙醇4 ml使溶解，即得。

表1 梯度洗脫條件

圖1 金絲桃苷薄層色譜圖(煙臺(tái)G板，批號(hào)2016110)

圖2 槲皮素、山柰素薄層色譜圖(煙臺(tái)G板，批號(hào)2016110)

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

取金絲桃苷、槲皮素、山柰素對(duì)照品分別加70%乙醇制成每1 ml各含0.5 mg的溶液，即得。

2.1.3 對(duì)照藥材溶液的制備

取照山白對(duì)照藥材粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，加70%乙醇20 ml，超聲處理10分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?0%乙醇1 ml使溶解，即得。

2.1.4 薄層色譜條件

照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法進(jìn)行。

色譜條件1：吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及金絲桃苷對(duì)照品溶液各1 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，展距10 cm，取出，晾干。

色譜條件2：吸取上述供試品溶液、槲皮素和山柰素對(duì)照品溶液各1 μl，對(duì)照藥材溶液2 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)已烷-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶0.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，展距10 cm，取出，晾干。

2.1.5 顯色觀察與結(jié)果

均噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果：供試品色譜中，在與對(duì)照藥材及各對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1、圖2。

2.1.6 耐用性試驗(yàn)

分別考察了4個(gè)廠家的硅膠G高效薄層板（煙臺(tái)化工、青島譜科、青島海洋、Merck）在不同溫濕度條件下的色譜結(jié)果，斑點(diǎn)均分離良好。

2.2 高效液相特征圖譜測(cè)定方法

2.2.1 對(duì)照品溶液制備

取金絲桃苷、槲皮素、山柰素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 ml各含100 μg、10 μg、3 μg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備

取本品10片，去包衣，研細(xì)，取0.3 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 ml，稱(chēng)定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

C18柱；乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸為流動(dòng)相B，按表1梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)366nm；柱溫30℃；流速1ml·min-1；進(jìn)樣10 μl。理論板數(shù)以金絲桃苷計(jì)不低于3 000。

2.3 高效液相特征圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（S1），按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按2.2.3色譜條件進(jìn)行分析，特征圖譜以金絲桃苷為參照峰，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.45%，表明重復(fù)性良好。

圖3 混合對(duì)照品(A)、對(duì)照特征圖譜（B）和10批次照山白浸膏片（C）HPLC色譜圖

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取同一批樣品（S1），按2.2項(xiàng)下方法制備和測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.20%，表明精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.3色譜條件，分別于0、2、6、12、24、48 h進(jìn)樣分析。結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.51%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 高效液相特征圖譜確立

取10批樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備和測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果10批樣品譜圖一致，見(jiàn)圖3-C。除特別小的峰外，將其中12個(gè)色譜峰做為特征峰，并按出峰時(shí)間順序進(jìn)行編號(hào)。峰5（金絲桃苷）面積最大，做為參照峰；峰11（槲皮素）、峰12（山柰素）明確歸屬。試驗(yàn)以此結(jié)果確定對(duì)照特征圖譜（見(jiàn)圖3-B）：供試品特征圖譜中應(yīng)有12個(gè)特征峰，與參照物（金絲桃苷）相對(duì)應(yīng)的為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)，規(guī)定值為0.63（峰1）、0.67（峰2）、0.71（峰3）、0.95（峰4）、1.00（峰S）、1.01（峰 6）、1.03（峰 7）、1.10（峰 8）、1.16（峰 9）、1.17（峰10）、1.65（峰11）、1.77（峰12）。

3 討論與分析

實(shí)驗(yàn)在建立TLC鑒別方法時(shí)，未能實(shí)現(xiàn)用同一展開(kāi)系統(tǒng)對(duì)3個(gè)已知成分的同時(shí)分離，故采用了2個(gè)展開(kāi)系統(tǒng)。在建立HPLC方法[4-5]時(shí)，對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)的確定，流動(dòng)相、提取溶劑和方法的選擇，不同色譜儀（Agilent 1 260，Waters e2695），不同色譜柱（Agilent ZORBAX、Thermo BOS HYPERSIL、SHISEIDO CAPCELL PAK）等進(jìn)行了系統(tǒng)考察。為分離出更多的成分峰，采用梯度洗脫并優(yōu)化梯度洗脫時(shí)間段及洗脫比例，最終選擇了本實(shí)驗(yàn)的色譜條件并通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證（含量測(cè)定另文報(bào)道），證實(shí)所選色譜系統(tǒng)適用性好，結(jié)果可靠。本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，適用于照山白浸膏片特征圖譜檢查。穩(wěn)定性方面，除考察了樣品溶液的穩(wěn)定性外（48小時(shí)），還對(duì)樣品在室溫下貯藏1—3年后的特征圖譜進(jìn)行考察，結(jié)果樣品穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)所建立的照山白浸膏片TLC鑒別方法及HPLC特征圖譜，是以承德地產(chǎn)野生照山白藥材為原料。在本研究前期，曾對(duì)不同產(chǎn)區(qū)（北京、承德與東北）和不同藥用部位（葉與帶葉枝梢）的照山白藥材進(jìn)行了比較研究，結(jié)果其TLC及HPLC特征圖譜確因生長(zhǎng)地域不同而略存差異，葉與帶葉枝梢差異不明顯。所以，有針對(duì)性地對(duì)特定產(chǎn)品制定標(biāo)準(zhǔn)，就能從源頭杜絕假冒，有效保護(hù)企業(yè)自有品種，為打造自有品牌提供技術(shù)支撐。照山白含浸木毒素等有毒成分，目前缺少相應(yīng)對(duì)照品，下一步將就安全性指標(biāo)進(jìn)行研究。

1 楊秀嶺,袁志芳,張?zhí)m桐,等.照山白總黃酮的藥理作用研究.中草藥,2006,37(4):583-584

2 張孟科,照山白、貴州鼠尾草和新疆鼠尾草化學(xué)成分及生物活性研究.武漢:華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文,2015:123-124.

3 李福榮,胡月華,張偉,等.泰山照山白提取物對(duì)過(guò)氧化損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2013,34(3):170-172

4 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典2015年版(一部).2015:309

5 王志軒,劉喜剛,崔小麗,等.HPLC法測(cè)定照山白中金絲桃苷、槲皮素和山柰素的含量.天津藥學(xué),2016(1):102-103.