照山白浸膏片TLC鑒別和HPLC特征圖譜研究＊

崔小麗，王志軒，邱明山，姚寶林，郭海平

（1.承德市食品藥品檢驗檢測中心 承德 067000；2.承德燕峰藥業有限責任公司 承德 067000）

照山白浸膏片由7%照山白飲片細粉和93%照山白飲片經水煮的浸膏混合制成的片劑，具有祛風散寒、活血通絡、祛痰止咳的功效，用于婦女產后風寒身痛、月經不調、痛經、老年慢性氣管炎。標準收載于《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第三冊，僅有顯微和理化鑒別，質控指標單一，專屬性差。有研究表明照山白葉中含皂苷、鞣質、還原性物質、多糖類、揮發油及黃酮類和酚酸類等，其中黃酮類成分有抗炎作用[1-3]。為提高產品質量控制水平，本實驗以照山白為對照藥材，金絲桃苷、槲皮素、山柰素為對照品，分別建立TLC鑒別方法和HPLC特征圖譜。

1 儀器與試藥

半自動點樣儀：CAMAG LINOMAT5；薄層色譜成像儀:CAMAG TLC VISUALIZER2；高效液相色譜儀：Waters e2695；電子天平：METTLER TOLEDO AG135；甲醇、乙腈（色譜純，菲舍爾公司）；甲醇、乙醇（分析純，天津市康科德科技）；娃哈哈純凈水。對照品（中檢院）：金絲桃苷（批號111521-201507）、槲皮素（100081-201509）、山柰素（110861-201310）。照山白對照藥材：采自承德豐寧，經鑒定為杜鵑花科植物照山白Rhododendron micranthum Turcz.的干燥帶葉枝梢。照山白浸膏片為承德燕峰藥業有限公司生產，10批次，原料為帶葉枝梢。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別方法

2.1.1 供試品溶液的制備

取本品1片，去包衣，研細，置具塞錐形瓶中，加70%乙醇20 ml，超聲處理10分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加70%乙醇4 ml使溶解，即得。

表1 梯度洗脫條件

圖1 金絲桃苷薄層色譜圖(煙臺G板，批號2016110)

圖2 槲皮素、山柰素薄層色譜圖(煙臺G板，批號2016110)

2.1.2 對照品溶液的制備

取金絲桃苷、槲皮素、山柰素對照品分別加70%乙醇制成每1 ml各含0.5 mg的溶液，即得。

2.1.3 對照藥材溶液的制備

取照山白對照藥材粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，加70%乙醇20 ml，超聲處理10分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加70%乙醇1 ml使溶解，即得。

2.1.4 薄層色譜條件

照《中國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法進行。

色譜條件1：吸取供試品溶液、對照藥材溶液及金絲桃苷對照品溶液各1 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開劑，展開，展距10 cm，取出，晾干。

色譜條件2：吸取上述供試品溶液、槲皮素和山柰素對照品溶液各1 μl，對照藥材溶液2 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環已烷-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶0.5）為展開劑，展開，展距10 cm，取出，晾干。

2.1.5 顯色觀察與結果

均噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，在紫外光燈(365 nm)下檢視。結果：供試品色譜中，在與對照藥材及各對照品色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點。見圖1、圖2。

2.1.6 耐用性試驗

分別考察了4個廠家的硅膠G高效薄層板（煙臺化工、青島譜科、青島海洋、Merck）在不同溫濕度條件下的色譜結果，斑點均分離良好。

2.2 高效液相特征圖譜測定方法

2.2.1 對照品溶液制備

取金絲桃苷、槲皮素、山柰素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml各含100 μg、10 μg、3 μg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備

取本品10片，去包衣，研細，取0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 色譜條件與系統適用性試驗

C18柱；乙腈為流動相A，0.1%磷酸為流動相B，按表1梯度洗脫，檢測波長366nm；柱溫30℃；流速1ml·min-1；進樣10 μl。理論板數以金絲桃苷計不低于3 000。

2.3 高效液相特征圖譜方法學考察

2.3.1 重復性試驗

取同一批樣品（S1），按2.2.2項下方法制備供試品溶液6份，按2.2.3色譜條件進行分析，特征圖譜以金絲桃苷為參照峰，計算各色譜峰的相對保留時間，結果各色譜峰的相對保留時間的RSD＜0.45%，表明重復性良好。

圖3 混合對照品(A)、對照特征圖譜（B）和10批次照山白浸膏片（C）HPLC色譜圖

2.3.2 精密度試驗

取同一批樣品（S1），按2.2項下方法制備和測定，連續進樣6次，結果各色譜峰的相對保留時間的RSD＜0.20%，表明精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗

按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.3色譜條件，分別于0、2、6、12、24、48 h進樣分析。結果各色譜峰的相對保留時間的RSD＜0.51%，表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.4 高效液相特征圖譜確立

取10批樣品，按2.2項下方法制備和測定，記錄色譜圖，結果10批樣品譜圖一致，見圖3-C。除特別小的峰外，將其中12個色譜峰做為特征峰，并按出峰時間順序進行編號。峰5（金絲桃苷）面積最大，做為參照峰；峰11（槲皮素）、峰12（山柰素）明確歸屬。試驗以此結果確定對照特征圖譜（見圖3-B）：供試品特征圖譜中應有12個特征峰，與參照物（金絲桃苷）相對應的為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，其相對保留時間應在規定值的±5%之內，規定值為0.63（峰1）、0.67（峰2）、0.71（峰3）、0.95（峰4）、1.00（峰S）、1.01（峰 6）、1.03（峰 7）、1.10（峰 8）、1.16（峰 9）、1.17（峰10）、1.65（峰11）、1.77（峰12）。

3 討論與分析

實驗在建立TLC鑒別方法時，未能實現用同一展開系統對3個已知成分的同時分離，故采用了2個展開系統。在建立HPLC方法[4-5]時，對檢測波長的確定，流動相、提取溶劑和方法的選擇，不同色譜儀（Agilent 1 260，Waters e2695），不同色譜柱（Agilent ZORBAX、Thermo BOS HYPERSIL、SHISEIDO CAPCELL PAK）等進行了系統考察。為分離出更多的成分峰，采用梯度洗脫并優化梯度洗脫時間段及洗脫比例，最終選擇了本實驗的色譜條件并通過方法學驗證（含量測定另文報道），證實所選色譜系統適用性好，結果可靠。本方法簡便、準確、重現性好，適用于照山白浸膏片特征圖譜檢查。穩定性方面，除考察了樣品溶液的穩定性外（48小時），還對樣品在室溫下貯藏1—3年后的特征圖譜進行考察，結果樣品穩定。本實驗所建立的照山白浸膏片TLC鑒別方法及HPLC特征圖譜，是以承德地產野生照山白藥材為原料。在本研究前期，曾對不同產區（北京、承德與東北）和不同藥用部位（葉與帶葉枝梢）的照山白藥材進行了比較研究，結果其TLC及HPLC特征圖譜確因生長地域不同而略存差異，葉與帶葉枝梢差異不明顯。所以，有針對性地對特定產品制定標準，就能從源頭杜絕假冒，有效保護企業自有品種，為打造自有品牌提供技術支撐。照山白含浸木毒素等有毒成分，目前缺少相應對照品，下一步將就安全性指標進行研究。

1 楊秀嶺,袁志芳,張蘭桐,等.照山白總黃酮的藥理作用研究.中草藥,2006,37(4):583-584

2 張孟科,照山白、貴州鼠尾草和新疆鼠尾草化學成分及生物活性研究.武漢:華中科技大學博士學位論文,2015:123-124.

3 李福榮,胡月華,張偉,等.泰山照山白提取物對過氧化損傷的PC12細胞的保護作用.泰山醫學院學報2013,34(3):170-172

4 國家藥典委員會.中國藥典2015年版(一部).2015:309

5 王志軒,劉喜剛,崔小麗,等.HPLC法測定照山白中金絲桃苷、槲皮素和山柰素的含量.天津藥學,2016(1):102-103.