內質網應激對大鼠局灶性腦缺血再灌注后聽皮層損傷的作用*

呂 哲,張 穎,時美娟,孟 晴,宋永周,路 虹△

(河北醫科大學第二醫院:1.耳鼻咽喉科;2.骨科，石家莊 050000)

研究表明腦缺血再灌注時缺血缺氧、自由基蓄積及三磷酸腺苷耗竭等都可能導致內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[1-2]。過度ERS可以引起神經細胞凋亡，進一步加重腦損傷。據報道聽力缺失與腦卒中密切相關[3]。眾所周知，聽皮層是聽覺系統的最高級中樞。初級神經元的退行性變及凋亡將導致中樞對傳入信息的感知能力下降，對聲音信息的認知和處理的能力下降。以往對缺血再灌注損傷導致的聽力損傷研究多集中于外周聽覺系統，而對中樞病變研究較少[4-6]。本研究通過建立局灶性腦缺血再灌注模型，觀察內質網應激相關因子葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-12(Caspase-12)在聽皮層的表達，闡述腦缺血再灌注對聽力損害的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性清潔級SD大鼠30只，體質量250～280 g，無耳毒性藥物使用史，無噪聲暴露史，耳廓反射靈敏，由河北醫科大學實驗動物中心提供。動物許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。飼養條件：以標準飼料喂養，恒溫20～25 ℃，晝夜交替。采用隨機數字表法把實驗動物分為兩組：缺血再灌注組(I/R組)15只，假手術組(Sham組)15只。

1.2儀器與試劑 ICS-CHARTR-EP型ABR電位儀(麥德森醫療器)，Tunel試劑盒(Roche公司)，三苯氯化四氮唑(TTC， Sigma公司)，兔抗鼠Caspase-12抗體、GRP78抗體(Santa Cruz公司)，免疫組織化學試劑盒(渤海生物工程有限公司)，羊抗兔IgG熒光抗體(碧云天生物技術有限公司)。

1.3方法

1.3.1MACO模型建立 大鼠以10%水合氯醛全身麻醉后，依次分離頸總動脈和頸內、頸外動脈，結扎頸外動脈遠端，頸外動脈上剪一小口，把標記好的栓線從切口處插入頸內動脈，隨后向上深入，大約距頸總動脈分叉處(18.5±0.5)mm，此時堵住大腦中動脈開口，隨即結扎固定，計時60 min，然后輕輕取出線栓。Sham組只進行血管分離并不插入線栓。24 h后進行檢測和處死、取材。

1.3.2神經功能缺失評分 采用改良Longa法，即單盲 6級5分法進行評分。0分：無神經損傷癥狀表現；1分：提尾時不能伸展對側的前肢；2分：提尾時對側的前肢屈曲；3分：行走時輕度向對側轉圈；4分：行走時向對側嚴重轉圈；5分：向對側跌倒，不能自主行走。

1.3.3聽性腦干反應(auditory brainstem response,ABR)測試 分別對造模前和造模24 h后的兩組動物進行檢測。檢測方法為：水合氯醛麻醉后置于隔聲屏蔽室內，選用聽性腦干誘發電位檢測儀，采用短聲為刺激聲，增益為50 k，速率為每秒21.1次，極性為交替波，觀察時程10 ms[7]。將初始刺激強度定為90 dB SPL，隨后以5 dB SPL逐漸遞減。直到遞減至出現2次ABR Ⅲ波的波形不一致,此時增加5 dB SPL進行檢測，當重復波形出現一致時,即可記為ABR的反應閾值。

1.3.4腦梗死體積測定 麻醉后每組取5只大鼠斷頭取腦，將其均勻切成5片冠狀切片，隨即浸入2%TTC溶液中染色30 min，在多聚甲醛溶液中固定24 h，取出拍照，計算梗死體積。腦梗死體積百分比=[總梗死體積-(梗死側半球體積-梗死對側半球體積)]/梗死對側半球體積×100%。

1.3.5HE染色觀察聽皮層組織學改變 大鼠全身麻醉后暴露心臟，自心尖處將灌注針插入，以4%多聚甲醛灌注，固定后取腦。準確取材聽皮層區域(參照《大鼠腦立體定位圖譜》)，組織置于固定液中24 h以上，之后石蠟包埋、切片。切片常規經脫蠟、初染、復染、脫水、封片等工序處理后進行觀察。

1.3.6原位缺口末端標記(TUNEL)法檢測凋亡神經細胞 常規處理制備好的石蠟切片后，按試劑盒說明書進行操作后，置于光鏡下觀察，若細胞核內為棕黃色即為陽性細胞。隨機選擇并計算5個高倍視野中的凋亡指數(AI)。AI=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%。

1.3.7免疫組織化學觀察聽皮層GRP78、Caspase-12表達 將經抗原修復，滅活酶后的石蠟切片，滴加一抗、二抗，DAB顯色及復染，封固后于顯微鏡下觀察。隨機選取5個不同的視野進行圖像分析(采用Image-Pro Plus6.0軟件)。

1.3.8蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測GRP78、Caspase-12蛋白表達 麻醉后取出大鼠梗死側聽皮層腦組織，迅速制備腦組織勻漿，在離心機中離心30 min后取上清液，進行蛋白定量。按說明書操作變性、上樣之后，電泳、轉膜，將其置入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗Caspase-12多克隆抗體，兔抗GRP78多克隆抗體，孵育過夜后洗膜，再加入羊抗兔IgG熒光抗體，孵育1 h，應用遠紅外熒光掃描成像系統，以β-actin的表達為內參照，測定目標帶單位密度， GRP78/β-actin、Caspase-12/β-actin比值代表蛋白相對表達水平。

2 結 果

2.1神經功能缺失評分、腦梗死體積比較 I/R組表現出不同程度的腦缺血性損傷，Sham組無行為學改變，經TTC染色后Sham組腦組織顯示出均勻的紅色。與Sham組比較，I/R組腦組織顯示為大范圍蒼白色梗死區域，兩組腦梗死體積、神經功能缺失評分、AI比較差異均具有統計學意義(P<0.01)，見表1。

2.2ABR反應閾 造模前兩組ABR反應閾比較差異無統計學意義(P>0.05)，造模后兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。I/R組造模前后差異有統計學意義，Sham組造模前后差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 大鼠神經功能缺損評分、腦梗死體積、AI比較

表2 ABR檢測結果

2.3聽皮層HE染色檢測組織學改變 經HE染色光學顯微鏡下觀察發現，Sham組神經元邊界清楚，結構完整，形態正常，高倍鏡下核仁清晰，細胞核圓而大， I/R組正常組織結構消失，細胞排列紊亂，細胞周圍空泡變，細胞質嗜伊紅，細胞核固縮、深染(圖1)。

2.4TUNEL法檢測凋亡神經細胞 缺血再灌注后24 h后，I/R組陽性細胞明顯增多，細胞形態上有改變，兩組AI比較差異具有統計學意義。提示缺血再灌注可以誘導細胞凋亡(表1、圖2)。

A：Sham組；B：I/R組

圖1聽皮層神經細胞HE染色(×200)

A：Sham組；B：I/R組；C：兩組AI比較,*：P<0.01，與Sham組比較

圖2聽皮層神經細胞TUNEL染色(×200)

A、D：Sham組；B、E：I/R組；C、F：兩組GRP78、Caspase-12蛋白表達比較;*：P<0.01，與Sham組比較

圖3聽皮層神經細胞GRP78 、Caspase-12免疫組織化學染色結果(×200)

2.5免疫組織化學觀察聽皮層GRP78、Caspase-12表達 GRP78抗原陽性細胞為深棕色，細胞質淡染；染色陰性細胞胞核呈藍色，細胞質未見染色。Sham組中，GRP78陽性細胞呈現少量表達，缺血再灌注后24 h，I/R組陽性細胞明顯增多，兩組比較差異具有統計學意義(P<0.01)。Caspase-12抗原陽性細胞呈棕黃色，以細胞質表達為主，在Sham組中微量表達，再灌注24 h后，I/R組陽性細胞較Sham組明顯增多，兩組比較差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

A、B：GRP78；C、D：Caspase-12;*：P<0.01,與Sham組比較

圖4 Western blot檢測GRP78和Caspase-12蛋白表達

2.6Western blot檢測GRP78、Caspase-12蛋白表達 Sham組大鼠腦組織僅有少量GRP78、Caspase-12蛋白表達，I/R組24 h表達GRP78、Caspase-12蛋白較Sham組明顯增加，兩組比較差異有統計學意義(圖4)。

3 討 論

聽皮層是大腦皮質的一個亞皮質區域，也是聽覺系統的最高級中樞，是眾多下調通路的源頭，能在聽覺系統的各個層面上影響神經信息處理。聽覺皮質接受來自大腦中動脈的血供，皮層的功能也與缺血性損傷密切相關。聽覺皮質神經元在缺血缺氧情況下容易發生細胞凋亡。課題組在前期的工作中采用夾閉雙側頸總動脈方法造成全腦缺血再灌注模型，觀察了內質網應激反應及相關因子在聽皮層的變化[7-8]。在本研究中，通過建立局灶性缺血再灌注模型，并通過神經功能評分、TTC染色證實模型制作成功。從形態學上可以觀察到I/R損傷區細胞有明顯的變化。對兩組大鼠進行ABR測試發現，與Sham組相比，I/R組顯示出ABR反應閾明顯升高。因此筆者推斷聽皮質損傷可能是聽力損傷早期階段最重要的改變。

內質網是細胞內蛋白質合成以及修飾的主要場所，同時也是細胞內鈣離子的儲存庫[9-11]。神經系統的內質網系統高度發達，對內外部環境的刺激如缺血缺氧、氧化應激及營養物質缺乏等非常敏感。當遇到各種有害刺激時，可以引起ERS，此時大量蛋白質在細胞內未正確折疊或錯誤折疊并大量堆積，從而導致鈣離子紊亂。當這些蛋白質少量出現時，可以通過內質網相關降解途徑進行清除。但大量出現并且超出了內質網的自身清除能力時，細胞內一系列級聯反應通路被激活，促使具有保護作用的蛋白質生成，使細胞免受應激反應的損傷，維護機體的內環境穩定和生理平衡，稱為非折疊蛋白反應(unfoldedproteinresponse，UPR)。但是如果嚴重而持續的ERS超過自身調節能力，則導致細胞凋亡和組織損傷[12-13]。

內質網應激相關性凋亡及凋亡相關蛋白近年來成為研究的熱點。ERS誘導的UPR主要通過轉錄激活因子-6(activating transcription factor 6,ATF-6)、蛋白激酶樣內質網激酶(phosphorylated extracellular signal regulated kinase,PERK)、肌醇依賴性蛋白激酶(inositol requiring enzyme 1,IRE1)3種感應蛋白介導的信號通路來實現[14]。GRP78被認為是ERS的經典標志物之一。在正常情況下與上述3個感應蛋白結合，封閉了它們的信號。當機體處于應激狀態下，GRP78首先被釋放出來與非折疊蛋白結合，達到阻止這些非折疊蛋白輸出內質網的目的，進而對細胞起保護作用[15]。在本研究中，局灶性缺血再灌注24 h后GRP78表達明顯上調提示，缺血再灌注啟動了ERS過程。

Caspase-12途徑是內質網應激引發凋亡的一個重要途徑。正常情況下Caspase-12是ERS誘發凋亡的特異性介質，非ERS相關刺激誘導的細胞凋亡中不被激活。研究表明,抑制Caspase-12介導的ERS通路后，缺血再灌注后的神經細胞凋亡可以減少。對于Caspase-12基因缺陷大鼠，可以抵抗由于內質網應激引起的凋亡，對于其他死亡刺激并不能抵抗凋亡的發生[16-17]。在本研究中，局灶性腦缺血再灌注后，缺血側聽皮層凋亡陽性細胞明顯增多，Caspase-12蛋白表達明顯增高，提示內質網應激啟動了相關凋亡途徑，并進一步激活相關級聯反應，導致神經元發生凋亡。

在腦缺血再灌注損傷過程中，內質網應激介導的凋亡途徑可能是腦缺血損傷聽皮層引發聽力下降的可能機制之一。因此，如何抑制內質網應激及其相關凋亡途徑，可為治療伴有腦血管疾病的突發性耳聾提供了新的研究思路及研究方向。

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