富氫鹽水對腎臟缺血再灌注損傷的保護作用機制

部 璇,王建軍,白 靜,程愛斌

(河北理工大學附屬醫院重癥醫學科，河北唐山 063000)

腎臟缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion,IR)是腎移植后較為嚴重的不可避免的并發癥，對移植后的腎臟是否能夠存活起到重要作用。引起腎臟IR的機制較為復雜，已有研究顯示，活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成及炎癥介質的釋放在腎臟IR中發揮重要作用[1-2]。增多的氧自由基可以進一步引起細胞內的損傷，包括DNA損傷、蛋白質氧化和硝基化、脂質過氧化及細胞凋亡等[3]。氫氣是一種惰性氣體，具有明確的抗氧化和清除自由基的作用。研究顯示，富氫溶液能夠有效減輕經冷凍保存后進行移植腎臟的IR損傷。但是，相應的作用機制尚不完全明確。因此，本研究利用小鼠模型，探討富氫鹽水(hydrogen-rich water,HRS)對小鼠腎臟IR損傷中氧化及細胞凋亡相關蛋白的影響，闡明HRS減輕腎臟IR損傷機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性ICR小鼠80只，SPF級，體質量25～30 g，合格證號SCXK(京)2012-0001，購自北京華阜康實驗動物有限公司。

1.2儀器與試劑 生理鹽水購自華潤雙鶴藥業股份有限公司；血生化檢測試劑盒購自成都斯瑪特科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；二辛可寧酸(Bicinchoninic,BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；哺乳動物組織總蛋白提取試劑購自武漢博士德生物工程有限公司；Bcl2，Bcl-xl,Bax，Bak,Cleaved Caspase-3抗體購自美國Cell Signaling Technology(CST)公司；β-actin、抗兔辣根過氧化物酶抗體、抗鼠辣根過氧化物酶抗體購自美國Abcam公司。富氫水杯購自廣州康旺電子科技有限公司；便攜式獸用生化檢測儀購自普朗醫療設備有限公司；可見光分光光度計購自上海精密科學儀器有限公司；凝膠成像系統購自美國BioRad公司。

1.3方法

1.3.1HRS制備 向富氫水杯內加入200 mL生理鹽水，按照廠家的操作步驟進行HRS的制備，每次使用時制備新的HRS。

1.3.2實驗分組及模型制備 實驗分為3組：對照(假手術)組，IR組，IR+HRS組，每組6只小鼠。IR+HRS組小鼠于手術前3 d及再灌注前1 min尾靜脈注射0.2 mL HRS，再灌注后的2 h內每隔0.5 h注射1次HRS。對照組和IR組小鼠尾靜脈注射相同體積的生理鹽水。小鼠用3.5%水合氯醛溶液進行麻醉，腹部備皮仰臥于手術臺上，對照組小鼠暴露腎臟并游離雙側腎蒂，但是不夾閉腎蒂。IR組和IR+HRS組用無損傷血管夾夾閉，45 min后松開恢復腎臟血流，肉眼觀察腎臟顏色確認腎臟再灌注是否成功，逐層關閉小鼠腹腔。

1.3.3血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)檢測 IR后24 h摘小鼠眼球取血，3 000 r/min離心10 min后取上清液即為小鼠血清。取100 μL血清加入血生化檢測試劑盤內，生化分析儀檢測SCr和BUN水平。

1.3.4腎組織SOD和MDA檢測 IR后24 h獲取小鼠腎臟，稱取1 g腎組織剪碎后放到玻璃勻漿器內，按照組織質量(g)∶體積(mL)=1∶10的比例加入預冷的生理鹽水，使用玻璃勻漿器勻漿，勻漿后的組織懸液以3 000 r/min離心10 min后取上清液，BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度，按照試劑盒的操作步驟進行SOD及MDA檢測。

1.3.5腎組織凋亡相關蛋白檢測 IR后24 h獲取小鼠腎臟，稱取1 g腎組織剪碎后放到玻璃勻漿器內，加入預冷的含1%蛋白酶抑制劑的哺乳動物組織總蛋白提取液，研磨組織后冰上裂解1.5 h,以12 000 r/min離心10 min后取上清液即為蛋白提取物。BCA法檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液后沸水煮蛋白8 min使蛋白變性。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣量為20 μg，電壓150 V,時間1.5 h。使用聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜轉膜。轉膜完成后使用5% BSA室溫封閉1 h，將膜放入兔抗Bcl2(1∶1 000)抗體,兔抗Bcl-xl(1∶1 000) 抗體,兔抗Bax(1∶1 000) 抗體,兔抗Bak(1∶1 000) 抗體,兔抗Cleaved Caspase-3(1∶1 000) 抗體,鼠抗β-actin(1∶10 000)抗體液中進行孵育，孵育條件為4 ℃過夜。用TBST沖洗3次后，加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠和抗兔抗體，室溫孵育1 h后，使用凝膠成像系統對蛋白條帶進行分析。統計結果以目的蛋白的灰度值與β-actin蛋白的灰度值的比值代表相對蛋白表達水平。

2 結 果

2.1HRS處理降低小鼠血清SCr和BUN水平的影響 與對照組比較，IR后24 h小鼠血清SCr和BUN顯著升高，HRS處理后IR小鼠血清SCr和BUN明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 HRS對小鼠血清SCr、BUN水平的影響

△:P<0.01，與對照組比較；*:P<0.01，與IR組比較

2.2HRS處理提高腎組織SOD酶活性同時降低MDA水平影響 與對照組比較，IR后24 h小鼠腎組織SOD酶活性顯著下降，MDA水平明顯增加，HRS預處理能夠提高IR小鼠腎組織SOD活性并降低腎組織內的MDA水平，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 HRS對小鼠腎臟SOD及MDA水平的影響

△：P<0.01，與對照組比較；*：P<0.01，與IR組比較

2.3HRS處理改變凋亡相關蛋白的表達 與對照組比較，I/R組抗凋亡蛋白Bcl2和Bcl-xl在IR后24 h表達下調，促凋亡蛋白Bax,Bak,Cleaved Caspase-3表達上調，HRS預處理能夠上調IR后小鼠腎組織抗凋亡蛋白表達，下調促凋亡蛋白表達，結果差異具有統計學意義(P<0.05),見圖1。

##:P<0.01，與對照組比較；*:P<0.05，**:P<0.01，與IR組比較

圖1 HRS對凋亡相關蛋白表達的影響

3 討 論

2007年日本OHSAWA等[4]報道氫氣能夠通過選擇性清除羥自由基降低腦組織的IR，直接證實氫氣作為抗氧化劑具有治療作用[4]。隨后，關于氫氣治療組織IR的研究越來越多，研究顯示，吸入氫氣或飲用富氫水能夠減輕大鼠或小鼠大腦、肝臟、腎臟、卵巢、肌肉、小腸等組織器官的IR[3,4-9]。據報道，將待移植的大鼠腎臟放入預冷的富氫溶液中保存24～48 h后，移植腎臟的功能和移植受體存活率得到極大的提高，其作用機制主要是減少腎小管上皮細胞的炎性反應和凋亡[1,8]，但是相關的信號通路變化并沒有得到深入研究。曾葵等[9]研究顯示，對大鼠IR模型在再灌注前10 min和再灌注后120 min持續進行吸入氫氣處理，能夠有效減輕大鼠腎臟損傷，但是作用機制也沒有深入研究[9]。因此，本研究以小鼠腎臟IR模型為研究對象，觀察靜脈注射HRS對小鼠IR后腎臟功能、腎臟SOD、MDA水平以及凋亡相關的信號通路影響，闡明HRS減輕腎臟IR損傷的作用機制。

CUI等[5]研究顯示，靜脈注射HRS 1 min后，腎臟氫氣濃度達到峰值，因此本研究選擇在腎臟IR前1 min靜脈注射HRS，IR后的2 h內每0.5小時注射1次HRS。結果顯示，HRS預處理能夠有效降低血清SCr和BUN水平，減輕腎功能損傷，這項結果與之前研究一致[9]。MDA是脂質過氧化反應中的中間產物，反映組織受氧自由基損傷的程度；SOD是體內超氧自由基的清除因子，SOD水平的高低決定組織清除自由基的能力[10]。本結果顯示，HRS處理能夠有效減輕MDA的產生，提高SOD酶活性，進而提高IR后腎組織抗氧化能力。

在細胞凋亡的過程中，Bcl2家族成員發揮著重要的作用。Bcl2家族可以分為兩大類，一類為抗凋亡蛋白包括Bcl2,Bcl-xl等蛋白，一類為促凋亡蛋白包括Bak，Bax等蛋白。而Caspase-3是凋亡級聯反應中最關鍵的凋亡蛋白酶，當收到上游凋亡信號后，Caspase-3被活化變成Cleaved Caspase-3,啟動凋亡的發生過程[11-12]。本研究結果顯示，腎臟IR后24 h Bcl2,Bcl-xl蛋白表達水平下調，Bak，Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達上調。HRS處理后能明顯上調Bcl2,Bcl-xl蛋白表達，下調Bak，Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達。

綜上所述，本研究結果顯示，靜脈注射HRS能夠減輕小鼠腎臟IR損傷，其作用機制可能是通過降低組織內的ROS水平，增加組織抗氧化能力，并且通過調節Bcl2家族成員蛋白及Caspase-3蛋白降低腎臟組織細胞凋亡。氫氣作為一種無毒無害的具有抗氧化能力的氣體，在臨床上有巨大的應用前景。關于氫氣對腎臟IR后炎癥細胞因子的影響在本研究中并沒有闡明，這項研究值得在以后的工作中深入開展。

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