Notch3、DLL1、CD133在結直腸腺癌中的表達及意義*

蔣海濤，王 紅

(遵義醫學院附屬醫院消化內科，貴州遵義 563003)

結直腸癌(CRC)是胃腸道最常見的惡性腫瘤之一，由于飲食結構與生活方式的改變，近年來其發病率呈明顯上升趨勢，高居惡性腫瘤第3位[1-2]。目前研究認為Notch信號通路及腫瘤干細胞(CSCs)在CRC的發生、發展中起至關重要的作用。CSCs是一類具有干細胞特性的細胞亞群，能產生異質性腫瘤細胞；CD133表達于多種腫瘤干細胞表面，是目前研究較為深入的CRC干細胞標志物之一。Notch信號通路在細胞的增殖、分化、凋亡中發揮著至關重要的作用，與CRC密切相關。研究表明在CRC中，Notch信號的異常表達可促使腫瘤干細胞發展為CRC，并且在促進CRC干細胞的自我更新、分化、選擇性吸收及分泌過程也起到重要作用。目前關于Notch信號通路與CD133在CRC中的研究很少，本研究利用免疫組織化學的方法檢測50份CRC標本中Notch3、DLL1、CD133的表達情況，結合患者臨床病理特征，旨在分析在CRC發生、發展的過程中上述指標的可能作用機制，探討其與CRC浸潤、轉移的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院病理科2013-2015年手術切除后存檔的50份結直腸腺癌標本，30例腺瘤標本(腺瘤組)，并取12份正常結直腸黏膜標本(正常組)。每份標本臨床、病理資料完整，所有患者術前均未行任何抗腫瘤治療，術后病理類型均經病理診斷證實。結直腸腺癌標本中，結腸腺癌30份，直腸腺癌20份，其來源患者中男25例，女25例，年齡26～77歲，中位年齡60歲，腫瘤直徑大于或等于5 cm 35例，<5 cm 15例；高分化腺癌13例，中分化腺癌32例，低分化腺癌5例；19例伴淋巴結轉移，31例不伴淋巴結轉移；Dukes分級，A/B期標本28例，C/D期標本22例；浸潤深度為T1/T2期標本8例，T3/T4期標本42例。

1.2主要試劑 兔抗人多克隆抗體Notch3及DLL1購自美國Abcam公司，兔抗人CD133多克隆抗體購自武漢博士德生物有限公司，DAB顯色試劑盒購自上海基因科技有限公司。

1.3免疫組織化學法 所有蠟塊標本連續切片，厚度約4 μm，經二甲苯室溫下脫蠟、梯度乙醇水化、檸檬酸鈉緩沖液高壓修復等步驟后，使用免疫組織化學SP法染色，DAB顯色，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。所用抗體濃度分別為：兔抗人Notch3多克隆抗體(1∶400)，兔抗人DLL1多克隆抗體(1∶400)，兔抗人CD133多克隆抗體(1∶200)。已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.4結果判斷 按照WOLFF等[3]及楊軍等[4]推薦標準，首先在低倍鏡下(放大100倍)閱覽整張切片，察看目的細胞(腺癌/腺瘤/正常結直腸細胞)中陽性細胞的分布情況，摒除背景著色及非特異染色，選擇高表達區域高倍鏡下(放大400倍)進一步觀察，計數5個高倍視野中細胞染色強度及陽性細胞數所占同類型細胞的百分比，根據染色結果，將染色強度分為4級。陰性：即無著色；弱陽性：小于10%的細胞出現不同程度的細胞質或細胞膜著色；陽性：10%～30%的細胞出現深棕褐色的細胞質或細胞膜著色，或小于或等于70%的細胞出現弱/中等強度的細胞質或細胞膜著色；強陽性：大于30%的細胞呈現強棕褐色的細胞質或細胞膜著色，或大于70%的細胞呈中等強度細胞質或細胞膜著色。

1.5統計學處理 使用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計數資料用百分率表示，采用χ2檢驗，各指標間相關性分析采用Spearman相關分析法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1Notch3、DLL1、CD133的表達情況 Notch3蛋白主要表達于細胞質，呈棕黃色顆粒；在正常組、腺瘤組、腺癌組的陽性表達率分別為8.3%(1/12)、26.7%(8/30)、64.0%(32/50)，見圖1、表1。Notch3在腺癌組的陽性表達率顯著高于腺瘤組和正常組，差異有統計學意義(P<0.05);在腺瘤組與正常組的表達，差異無統計學意義(P>0.05)。DLL1蛋白主要表達于細胞膜和細胞質，呈棕黃色顆粒；在正常組、腺瘤組、腺癌組的陽性表達率分別為16.7%(2/12)、33.3%(10/30)、68.0%(34/50)，見圖2、表1。DLL1在腺癌組的陽性表達率顯著高腺瘤組和正常組，差異有統計學意義(P<0.05);在腺瘤組與正常組的表達，差異無統計學意義(P>0.05)。CD133蛋白主要表達于細胞質和細胞膜，亦呈棕黃色顆粒；在正常組、腺瘤組、腺癌組陽性表達率分別為8.3%(1/12)、36.7%(11/30)、54.0%(27/50)，見圖3、表1。CD133在腺癌組的陽性表達率亦顯著高于腺瘤組和正常組，差異有統計學意義(P<0.05);在腺瘤組及正常組的表達差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2Notch3、DLL1、CD133蛋白的表達與結直腸腺癌患者臨床病理特征的關系 Notch3的表達與患者年齡、性別、腫瘤發生部位、分化程度、浸潤深度、腫瘤大小無關(P>0.05)；分別與Dukes分期和淋巴結轉移有關(P<0.05)；伴有淋巴結轉移組陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移組，Dukes分期越高陽性率越高。DLL1的表達與腫瘤Dukes分期、浸潤深度、淋巴結轉移情況有關(P<0.05)，腫瘤的Dukes分期越高、浸潤深度越深陽性率越高，伴有淋巴結轉移組陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移組；與患者年齡、性別、腫瘤發生部位、分化程度及腫瘤大小無關(P>0.05)。CD133的表達與腫瘤的淋巴結轉移情況有關(P<0.05)，伴淋巴結轉移組陽性率顯著高于不伴淋巴結轉移組；而與年齡、分化程度等其他臨床病理資料無關(P>0.05)，見表2。

A:正常組;B:腺瘤組;C:腺癌組

圖1 Notch在3組中的表達(×200)

A:正常組;B:腺瘤組;C:腺癌組

圖2 DLL1在3組中的表達(×200)

A:正常組;B:腺瘤組;C:腺癌組

圖3 CD133在3組中的表達(×200)

2.3Notch3、DLL1、CD133表達的相關性 在Notch3蛋白陽性表達的32份結直腸腺癌組織標本中，CD133蛋白的陽性表達率為85.2%(23/27)；在Notch3蛋白陰性表達的18份結直腸腺癌組織標本中，CD133蛋白的陽性表達率為22.2%(4/18)；Spearman相關分析法統計分析顯示，在結直腸癌中Notch3與CD133表達呈正相關關系(r=0.478，P=0.000)。Notch3與DLL1及DLL1與CD133表達均無明顯相關性，見表3。

表2 Notch3、DLL1、CD133蛋白表達與結直腸腺癌患者臨床病理特征的關系(n)

續表2 Notch3、DLL1、CD133蛋白表達與結直腸腺癌患者臨床病理特征的關系(n)

表3 Notch3與CD133蛋白在結直腸腺癌中表達的相關性

3 討 論

Notch信號通路和腫瘤干細胞是目前腫瘤研究的熱點。Notch信號通路主要由5種Notch配體、4種Notch受體及轉錄因子CSL構成，5種Notch配體分別為DLL1、DLL3、DLL4以及Jagged1和Jagged2，4種Notch受體分別為Notch1、Notch2、Notch3及Notch4。經典的Notch信號轉導活化需經歷3次裂解(S1、S2、S3)，產生Notch的活化片段NIC，NIC進入細胞核內并與轉錄因子CSL結合，共同形成轉錄活化復合體，從而調控下游基因的轉錄與表達。

Notch通路與多種實體腫瘤密切相關，大量研究表明，在CRC中Notch基因常出現異常表達。Notch3是Notch通路的受體之一，定位于19q12染色體；DLL1基因定位于6q27染色體，是Notch通路的配體之一。目前Notch3的研究主要集中在肺癌和卵巢癌，DLL1主要在神經系統疾病方面研究較多，在CRC中的研究均較少。研究指出激活Notch3信號通路可促進CRC細胞的生長及遷移[5-6]，而miR-206通過下調Notch3基因的表達使腫瘤的增殖與轉移受到抑制[7]。本研究發現Notch3在正常結直腸黏膜組、腺瘤組、腺癌組中的表達呈逐漸遞增趨勢，表明高表達的Notch3與結直腸癌的發生、發展密切相關，且Notch3的表達與Dukes分期及淋巴結轉移相關，提示Notch3與腫瘤的轉移有關，與文獻報道相符。DLL1在結腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌中均高表達，在結腸癌中DLL1的陽性表達率約58%[8]；而本課題組前期的研究也發現，在結腸癌細胞HT-29中DLL1蛋白高表達，加用Notch信號通路阻斷劑DAPT作用于該細胞后，其陽性強度和陽性表達率均明顯下降[9]，進一步證實了DLL1的表達與CRC密切相關。本試驗中DLL1在正常組織、腺瘤、腺癌中表達率逐漸升高，在腺癌中陽性表達率達68.0%，與既往文獻報道相符，結合臨床病理特征發現，DLL1的表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及Dukes分期有關，提示其可能參與了CRC的發展及轉移。對Notch3和DLL1的相關性分析發現，二者在結直腸腺癌中的表達并無明顯相關性，提示在結直腸腺癌中Notch3和DLL1基因可能扮演致癌/促癌基因的角色，同時二者又互相獨立，并無相互作用。通過圖1及圖2可以發現，與正常結直腸腺管比較，結直腸腺癌的腺管明顯增粗，且細胞核排列紊亂、大小不一，提示Notch3和DLL1的高表達可能導致正常結直腸腺上皮過度增殖，并進一步導致CRC的發生。此外結合患者臨床病理資料分析，Notch3和DLL1的異常表達可能與結直腸腺癌的發展、轉移存在著某種關系，將有望成為新的腫瘤標記物推測結直腸癌患者的預后。

腫瘤干細胞是目前研究的熱點，腫瘤干細胞學說認為，CSCs是腫瘤組織中具有干細胞特性的一類細胞亞群，能產生異質性腫瘤細胞，不僅具有自我更新與無限增殖能力，還具有多向分化潛能，是惡性腫瘤的起源。CD133表達于多種腫瘤干細胞表面，是目前研究較為深入的結直腸癌干細胞標志物之一。與癌旁正常組織相比，CD133在CRC中的表達明顯升高[10]，且與淋巴結轉移相關[11]，與本研究結果一致。HONG等[12]研究指出，CD133的表達與CRC患者臨床病理分期及預后均密切相關。本研究發現，CD133在CRC組織中的陽性表達率明顯高于腺瘤組及正常組，結合臨床病理資料進一步分析，CD133在CRC中的表達與淋巴結轉移有關，伴有淋巴結轉移組陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移組，說明CD133蛋白表達陽性的患者更易出現淋巴結轉移，與文獻報道相符。

Notch通路與CSCs關系密切，Notch信號在維持CSCs特性中發揮關鍵作用，Notch信號通路激活后有利于CSCs的自我更新和存活，刺激CSCs增殖，最終形成腫瘤。在髓母細胞瘤中，阻斷Notch信號通路后，CD133表達陽性的細胞數量降低了5倍[13]。在CRC中，眾多腫瘤干細胞標志物(如：CD133、CD44、LGR5、Hes1、MUSASHI-1等)的表達與Notch信號通路明顯相關[14-15]。APOSTOLOU等[16]發現Notch受體在結腸癌干細胞中高表達，敲除不同的Notch受體對干細胞轉錄因子(Sox2，Oct4,Nanog)、CD44、Met原癌基因及二肽基肽酶-4均有不同程度的影響。本研究中，Notch3和CD133在CRC組織中均高表達，相關性分析顯示，二者在結直腸腺癌組織中的表達呈明顯正相關關系(r=0.478，P=0.000)，提示Notch3和CD133基因之間也許存在某種關聯，Notch3信號通路是否通過對CSCs的調控而影響CRC的發生、發展，值得進一步研究。

綜上所述，Notch3、DLL1、CD133的異常表達參與了CRC的發生、發展過程，了解Notch3、DLL1、CD133蛋白的表達情況，對于評估CRC的發展及預后具有重要意義。Notch3與CD133的表達存在正相關關系，提示CRC的形成可能是由于Notch信號通路對CSCs的調控失調所致，進一步深入研究對闡明CRC的發生機制及靶向治療具有重要意義。

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