乳腺癌干細胞的樹突狀細胞疫苗對細胞毒性T淋巴細胞增殖的影響

彭瑩瑩 葉小磊

近年來研究發現，癌細胞中有一部分被認為具有干細胞特性，可起始腫瘤形成并維持腫瘤的持續生長，這類細胞被稱為腫瘤干細胞樣細胞，它們在腫瘤的形成與發展過程中起著重要作用[1-3]。人類乳腺癌干細胞（BSC）具有干/祖細胞特性，即增殖性、自我更新和一定的分化能力等[3]，但多數情況下BSC不表達腫瘤抗原，可逃避免疫監視[4-5]，這與乳腺癌的復發及耐藥相關。目前尚無有效的治療手段對BSC進行干預[6-8]。臨床試驗顯示，樹突狀細胞（DC）疫苗對雌激素受體（ER）/孕激素受體（PR）雙陰性或三陰性Ⅱ/Ⅲa期乳腺癌患者具有治療效果，但這種免疫治療方法局限于部分乳腺癌患者。目前，已有研究證實異質腫瘤可用作抗原以產生效應T細胞或誘導DC疫苗[9-10]，但耐藥率較高。因此，從增強患者自身免疫力的角度，探索一種新的免疫治療手段是目前腫瘤綜合治療的研究熱點。本研究首先從乳腺癌患者中分離獲得BSC，并進行三維培養及表型鑒定，觀察BSC的DC疫苗對細胞毒性T淋巴細胞（CTL）增殖的影響，以探討BSC作為抗乳腺癌DC疫苗加載抗原的潛力。

1 材料和方法

1.1 主要材料及儀器 膠原酶/透明質酸酶1∶1溶液（400IU/mg，美國Sigma公司）；表皮細胞生長因子（EGF）（0.1ng/ml，美國 Peprotech公司）；胰島素（23.7IU/mg，美國 Sigma 公司）；B27（10ml，美國 Gibco 公司）；DMEMF12（50L，美國 Gibco公司）；抗 CD44-PE、抗 CD24-FITC、CD133-PE（125μl，美國 BioLegend 公司）；Ficoll/Paque（100ml，美國 Invitrogen 公司）；Bio-Rad 蛋白測定試劑（440次標準測試，美國Bio-Rad公司）；免疫球蛋白測定（ELISPOT）試劑盒（50次，美國R&D Systems公司）；乳酸脫氫酶釋放測定試劑盒（CytoTox 96非放射性細胞毒性測定，美國Promega公司）。超聲波細胞分離裝置（Biosafer150-96，賽飛中國生物科技有限公司）；流式細胞儀（Attune Nxt，美國Life technology公司）。

1.2 BSC的分離培養 經醫院倫理委員會討論通過且所有患者簽署知情同意書，采集2017年3月10日至6月10日收住寧波市醫療中心李惠利醫院甲乳外科的11例乳腺癌患者手術切除的腫瘤組織，臨床診斷經組織學和病理學確認。組織離體2h內作以下處理（按照乳腺癌細胞球的培養方法進行[11-12]）：用眼科剪將組織進行機械分解，放入膠原酶/透明質酸酶1∶1溶液中，37℃孵育4h；經40μm濾器過濾，將單細胞以1 000個/ml鋪板（通過Poly-Hema 4℃預包被），培養基中含有 bFGF 10ng/ml、EGF 20ng/ml、胰島素 5μg/ml、B27添加劑的無血清DMEM-F12。此條件下生長的細胞被稱為懸浮生長的球形細胞簇，每隔3～5d，胰酶37℃消化15min。

1.3 BSC的鑒定 使用流式細胞儀鑒定BSC標志物在細胞球或血清條件下培養的貼壁細胞中的表達。使用的抗體是CD44-PE、CD24-FITC和CD133-PE。使用小鼠IgG1抗體作為Bio-Legend抗體的同種型對照。細胞加入胰酶37℃消化5min后，吹打重懸成單細胞懸液，調整細胞密度為1×106個/ml，將抗體加入到細胞懸液中，避光孵育30min，進行流式細胞儀檢測[13]。

1.4 負載BSC抗原的DC刺激CTL后的殺傷效果以及IFN-γ檢測 通過Ficoll/Paque從健康供體的外周血單核細胞（PBMCs）制備人未成熟 DC。將 PBMCs（9×106個細胞/3ml/孔）接種到含有RPMI1640的6孔板中，37℃孵育1.5h，取貼壁細胞用于DC的傳代培養。使用超聲波細胞分離裝置將培養好的BSC制備為細胞懸液，取3～6百萬個細胞（包括BSC）的蛋白裂解液作為刺激抗原。使用Bio-Rad蛋白測定試劑檢測腫瘤抗原蛋白濃度。用含有BSC裂解物的自體DC（BSC裂解劑和DC在用淋巴細胞接種之前共同培養過夜）以5∶1的比例刺激非黏附淋巴細胞。將300IU/ml IL-2加入培養基中，每隔3d加1次。淋巴細胞每5d用DC刺激3次以上，最終將產生超過90%的CD3+T細胞（數據未顯示）。根據說明書，使用乳酸脫氫酶釋放測定試劑盒測試CTL介導的BSC細胞毒性。靶細胞是乳腺癌的細胞球和貼壁細胞。以未接受DC刺激的CTL為空白對照組。效應細胞和靶細胞的比例為 2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1和40∶1。細胞毒性抑制率計算公式：細胞毒性（%）=將 激 發 的CTL 按 2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1 和 40∶1 的比例調整為 1×104個/ml孵育24h，并通過ELISPOT試劑盒測定IFN-γ的釋放水平。使用CTL分析儀對激發細胞中BSC特異性CTL的斑點計數和覆蓋面積進行分析。

1.5 統計學處理 應用SPSS16.0統計軟件。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌細胞球的生長及BSC的特征 在DMEM/F12培養基中，一些細胞培養48h后逐漸形成小型細胞球，且不斷生長形成較大的細胞球，見圖1；其他細胞凋亡或保持未分化。通過流式細胞儀測定CD44和CD24標志物的表達：例1、例5患者乳腺癌細胞球中CD44+、CD24-的細胞比例分別為97.76%和99.60%，見圖2；例4、例7患者貼壁單層和乳腺癌細胞球中CD44+、CD24-的細胞比例分別為0.06%和91.83%，但CD44+、CD24+雙陽性細胞的的比例在貼壁細胞（60.57%）而非乳腺癌細胞球（0.75%）中強烈表達，見圖3。例4患者貼壁細胞、例5患者乳腺癌細胞球中CD133+細胞比例分別為44.56%和97.20%，可見CD133在乳腺癌細胞球中高表達，見圖4。

圖1 乳腺癌細胞球顯微鏡下形態（a：例1患者，b：例5患者）

圖2 流式細胞儀檢測乳腺癌細胞球中CD44、CD24的表達（a-c：例1患者乳腺癌細胞球表達CD44，但不表達CD24；d-f：例5患者乳腺癌細胞球表達CD44，但不表達CD24）

圖3 流式細胞儀檢測貼壁單層及乳腺癌細胞球中CD44、CD24的表達（a-c：例4患者貼壁單層表達CD44和CD24；d-f：例7患者乳腺癌細胞球表達CD44，但不表達CD24）

圖4 流式細胞儀檢測貼壁細胞及乳腺癌細胞球中CD133的表達（a-c：例4患者貼壁細胞低表達CD133；d-f：例5患者乳腺癌細胞球高表達CD133）

2.2 CTL介導的BSC細胞毒性 使用從源自細胞球或貼壁細胞的裂解物致敏的DC在體外刺激CTL，以確定使用富含乳腺癌細胞球的腫瘤干細胞（CSC）進行DC疫苗接種的效果。細胞球源自CD44+、CD24-的細胞比例為99.60%的例5患者（BSC-5），并保持類似培養條件用于培養衍生自BSC-5的乳腺癌細胞球細胞。成熟的DC能高度表達共刺激分子 CD80、CD86、CD83和 CD40[16-18]。使用CTL細胞毒性測定法測試刺激的細胞對BSC和BAC的細胞毒性。來自乳腺癌細胞球（BSC-CTL組）、貼壁細胞（BAC-CTL組）和空白對照（Blank-CTL組）的裂解物致敏的DC刺激CTL活性。針對腫瘤細胞的細胞溶解活性隨著效應物∶靶細胞（E∶T）的比例增加而增加。BSC-CTL組乳腺細胞球的細胞毒性明顯高于Blank-CTL（P＜0.05），見圖 5a；而 BSC-CTL 組乳腺細胞球與貼壁細胞間的細胞毒性差異無統計學意義（P＞0.05）。BSC-CTL組乳腺細胞球的細胞毒性明顯高于BACCTL組（P＜0.05），見圖5b。BAC-CTL組乳腺細胞球的細胞毒性與Blank-CTL組相似。BAC-CTL組對貼壁細胞的細胞毒性高于乳腺細胞球（P＜0.05），見圖5c。BAC-CTL組、BSC-CTL組對貼壁細胞的細胞毒性高于Blank-CTL 組（P＜0.05），見圖 5d。

2.3 DC疫苗接種效果 使用來自乳腺癌細胞球和貼壁細胞的裂解物作為抗原，每一種抗原刺激PBMCs均誘導明顯的T細胞應答，BSC-CTL組、BAC-CTL組、Blank-CTL組乳腺癌細胞球細胞通過IFN-γ ELISPOT分析產生點，見圖6。使用E∶T=40∶1的比例，BSC-CTL組、BAC-CTL組對大面積球細胞分別產生47、25個斑點。對斑點計數、覆蓋面積的觀察，可見BSC-CTL組的IFN-γ產生明顯高于BAC-CTL組（均P＜0.05）；BSCCTL組、BAC-CTL組的IFN-γ產生均高于Blank-CTL組（均P＜0.05）。同時，提高E∶T比例，會增加ELISPOT測定IFN-γ的斑點計數和覆蓋面積，見圖7。

3 討論

最近研究表明，小部分BSC亞群有助于乳腺癌的治療，預防耐藥性。目前關于BSC譜系的鑒定及分類尚不清楚。本研究分離并評估了來自臨床乳腺癌患者的BSC，并獲得了細胞球，與體內貼壁細胞相比具有更強的致瘤能力。為有效改善耐藥性，需要研究新的治療策略，如免疫治療或靶向BSC的藥物等。相關研究證實，用雙硫侖封裝的脂質體阻斷轉錄因子NF-κB活化，并在體外和體內特異性靶向CSC群體[19-20]。也有研究表明，DC可用于靶向CSC。通過用衍生自膠質瘤干細胞的裂解物和致敏的DC進行疫苗接種，引發的T細胞能夠選擇性靶向CSC。與乙醛脫氫酶（ALDHhigh）CSC裂解物致敏的DC相比，黑素瘤和鱗狀細胞癌模型中未分離的全細胞裂解物致敏的DC明顯誘導更高的保護性抗腫瘤免疫性。本研究結果表明，與用貼壁細胞的裂解物致敏的DC相比，細胞球裂解物致敏的DC明顯刺激了CTL，獲得更高的細胞毒性。BSC-CTL組對細胞球細胞的細胞毒性與貼壁細胞差異無統計學意義，且與Blank-CTL組比較差異亦無統計學意義。此外，還發現BAC-CTL組對貼壁細胞的細胞毒性明顯高于細胞球細胞。可見，用BSC致敏的DC接種后的優異的免疫應答刺激了Th1應答，可能由于抗原特異性CTL的靶細胞識別有所改善。

圖5 乳腺癌細胞球和貼壁細胞裂解物致敏分離DC活化的CTL對BSC、BAC的細胞毒性（a：BSC與BAC裂解物致敏分離DC對BSC的細胞毒性；b：BSC與BAC致敏分離DC對BSC的細胞毒性；c：BAC致敏分析DC對BSC、BAC的細胞毒性，均不存在抗原；d：BAC裂解物和無抗原分別致敏，檢測DC對BSC、BAC的細胞毒性；*P＜0.05）

圖6 BSC-CTL組、BAC-CTL組和Blank-CTL組乳腺癌細胞球細胞通過IFN-γELISPOT分析產生點圖（a：BSC-CTL組；b：BAC-CTL組；c：Blank-CTL 組）

圖7 BSC-CTL組、BAC-CTL組和Blank-CTL組的IFN-γ ELISPOT結果（a：斑點計數的井區分析；b：覆蓋面積的井區分析）

使用IFN-γ ELISPOT測定分析建立的CTL克隆，證實腫瘤抗原負載的DC明顯誘導IFN-γ產生[21-22]。本研究結果表明，使用BSC裂解液的DC疫苗接種可以誘導IFN-γ產生，與刺激的CTL數量呈正相關。提高E∶T的比例與CTL的斑點計數及覆蓋面積增加有關。通過斑點計數、覆蓋面積的比較，BSC-CTL組的IFN-γ產生高于BAC-CTL組；BSC-CTL組、BAC-CTL組的IFN-γ產生明顯高于Blank-CTL組。DC誘導的IFN-γ產生可能是由進一步刺激Th1應答的抗原特異性CTL激活引起的。

綜上所述，乳腺癌細胞球細胞具有干細胞特性和強致瘤功能，使用BSC抗原的DC接種可引發有效的抗原特異性Th1應答，進一步激活抗原特異性CTL并誘導IFN-γ產生。由此可見，BSC的DC疫苗具有優異的抗腫瘤免疫力，有助于BSC特異性免疫治療和癌癥疫苗的開發。

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