miR-455-5p在結直腸癌中的表達及生物學特性

王金秋 魯楊 柯孔亮 張樂鳴

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的惡性腫瘤，占全球癌癥死亡原因的第3位[1]。而我國CRC發(fā)病率及死亡率均位居世界首位[2]。CRC的發(fā)展是一個多步驟、多因素的過程，而其中的機制至今尚未完全清楚[3]。微小RNA（miRNA）是一類長度為22～25個核苷酸的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)miRNA通過調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中多個關鍵的步驟及基因，在細胞生長、分化及凋亡等多種生物過程中發(fā)揮作用，是腫瘤的潛在治療靶點和預后預測指標[5-7]。miR-455-5p位于第6條染色體上，多項研究發(fā)現(xiàn)它在甲狀腺髓樣癌[8]、黑色素瘤[9]、胃癌[10]等呈低表達。目前關于miR-455-5p在CRC的作用研究較少，故筆者擬探討miR-455-5p在CRC中的表達及生物學特性，以初步明確其靶基因，探討可能存在的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集寧波市第一醫(yī)院2016年3至7月收治的40例CRC患者經(jīng)手術切除的癌組織標本及癌旁10cm的正常黏膜組織標本，其中直腸標本21份，結腸標本19份；組織標本離體后立即放入RNA保存液中，后轉入-80℃冰箱中保存。40例CRC患者中，男24例，女 16 例；年齡 43～85（65±11）歲，≥60 歲 28 例，＜60歲12例；TNM臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期17例，Ⅲ期19例，Ⅳ期4例；腫瘤分化程度為中分化28例，中-低分化5例，低分化7例。所有患者術前未行放化療或免疫治療，無其他腫瘤疾病史。本研究經(jīng)寧波市第一醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.1.2 細胞株 人結腸癌 SW-480、HCT-116、HT-29細胞株，購自上海諾百公司。

1.1.3 試劑及儀器Trizol Reagent（15596-026，invitrogen公司）；氯仿（AR級，上海國藥）；異丙醇（AR 級，上海國藥）；75%無水乙醇（AR級，上海國藥）；焦碳酸二乙酯水（750024，invitrogen公司）；RNase抑制劑（E00381，上海拜力生物公司）；特異性引物（Oligo，invitrogen公司）；100mM dNTPs（18427013，invitrogen 公司）；Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒（KGA1018，凱基生物公司）；0.05%胰蛋白酶（25200-072，IVGN公司）；蛋白標志物（DM111-01，北京全式金生物公司）；DMEM（SH30023.01B，上海魯汶生物公司），F(xiàn)BS（S1810-500，Biowest南美血源公司）；Brdu細胞增殖檢測試劑盒（ED1100，Boster公司），Brdu細胞增殖抗體（BM0201，Boster公司），Brdu抗體對應熒光二抗[aatbio，iFluorTM488 goat anti-mouse IgG（H+L），賽默飛公司]；RIPA 蛋白裂解液（杭州昊鑫生物公司），CO2培養(yǎng)箱（HFI51，力康），熒光顯微鏡（IX51，奧林巴斯），顯微鏡（CKX31，奧林巴斯）；生物安全柜（HFsafe 1200 A2，力康），流式細胞儀（BD FACSCALIBUR，碧迪醫(yī)療）。

1.2 方法

1.2.1 組織標本RNA提取 將組織標本進行研磨、貼壁等預處理后，置于無RNA酶溶液的1.5ml離心管中，加入1ml Trizol，劇烈搖晃、吹打，按照試劑盒說明書的步驟提取總RNA。

1.2.2 qRT-PCR法檢測miR-455-5p表達水平 按照說明書進行操作。逆轉錄體系為20μl。按下列反應條件進行逆轉錄：25℃ 5min，50℃ 60min，70℃ 15min。每個樣本PCR反應總量共20μl，按以下條件在定量PCR儀上進行反應：95℃ 2 min，95℃ 10s，60℃ 60s，70℃ 45s，共40個循環(huán)。miR-455-5p的表達水平采用2-ΔΔCt法分析，并以相對表達定量值表示[ΔΔCt=待測樣品（MeanCt目-MeanCt內(nèi)）-對照樣品（MeanCt目-MeanCt內(nèi)）]。miR-455-5p、PIK3R1及U6的引物序列見表1。

表1 miR-455-5p、PIK3R1及U6的引物序列

1.2.3 CRC細胞轉染 選擇細胞狀態(tài)良好的SW480、HCT-116、HT-29細胞進行培養(yǎng)，使細胞生長至密度為70%～80%。采用脂質(zhì)體轉染試劑轉染3株細胞，其中miR-455-5p-mimics為miR-455-5p模擬劑，mimics-NC為 miR-455-5p-mimics對照組；miR-455-5p-inhibitor為 miR-455-5p抑制劑，inhibitor-NC為miR-455-5p-inhibitor對照組；Vehicle control為空白對照組。

1.2.4 Brdu增殖實驗檢測轉染后CRC細胞增殖能力收集轉染 miR-455-5p-inhibitor、miR-455-5p-mimics、mimics-NC、inhibitor-NC 48h 后的 SW-480、HT-29、HCT-116細胞，制成細胞懸液并計數(shù)。在24孔板中添加培養(yǎng)基并加入生長細胞，將細胞懸液以1～2萬個細胞/孔加入到24孔板中。加Brdu孵育1h，濃度10μmol/L。在室溫下進行細胞固定、0.25%TRITONTM X-100/PBS通透、2mol/L HCL變性等操作。用1%BSA/PBS稀釋Brdu抗體進行一抗孵育2h，溫度37℃。用1%BSA/PBS稀釋熒光二抗進行二抗孵育45min，溫度37℃，避光。在室溫狀態(tài)下用DAPI進行染核10min，避光。PBS洗5min，重復2次。Brdu能夠代替胸腺嘧啶而滲入正在復制的DNA分子中，然后用熒光標記的Brdu抗體進行染色，并在熒光顯微鏡下觀察熒光染色細胞比例，顯示熒光的細胞即增殖的CRC細胞。

1.2.5 流式細胞儀檢測轉染后CRC細胞凋亡率 將轉染48h后收集的細胞，接種至細菌培養(yǎng)板中培養(yǎng)條件改為2%FBS的完全培養(yǎng)基（誘導凋亡條件），通過胰酶細胞消化、培養(yǎng)箱孵育、離心等操作后，加入Annexin VPE/7-AAD進行染色，1h內(nèi)通過流式細胞儀進行檢測，用熒光顯微鏡觀察，將細胞混合液離心，取細胞沉淀涂片再行觀察。流式凋亡圖左下為正常細胞，左上為早期凋亡細胞，右上為晚期凋亡細胞，右下為碎片、損傷細胞、壞死細胞。

1.2.6 劃痕實驗檢測轉染后CRC細胞遷移能力 收集轉染成功的HT-29細胞，制成細胞懸液并計數(shù)。轉染前1d用槍頭在24孔板背后，用直尺比著、均勻地劃橫線，每隔0.5～1cm劃一道線，橫穿過孔。用200μl槍頭比著直尺垂直劃痕，用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。在 0、6、12、24h的時點進行取樣、拍照；使用 ipwin32軟件進行面積和長度的分析，計算寬度值。

1.2.7 Western blot法檢測PIK3R1蛋白表達 轉染miR-455-5p-inhibitors、miR-455-5p-mimics、mimics-NC、inhibitor-NC 48h后收集細胞沉淀，用0.01mol/L的PBS沖洗3次，加入RIPA蛋白裂解液充分裂解，離心，取上清液，測定總蛋白濃度。上樣完畢后，用聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。電泳結束后，在4℃條件下23V電壓濕轉12h。取下轉膜后的膜，用PBST洗滌4次，5min/次。將膜置于質(zhì)量百分比為5%的脫脂奶粉中，室溫封閉，37℃1h。膜在一抗稀釋液中4℃過夜。次日將膜取出后用PBST洗膜4次，5min/次。膜在稀釋二抗中37℃反應1h，室溫孵育1h。TBST漂洗5min×6次。暗室內(nèi)浸入ECL液顯色并使膠片曝光，洗片。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，計量資料用表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-455-5p在組織中的表達情況 miR-455-5p在CRC組織中的相對表達量為0.59±0.34，明顯低于癌旁正常黏膜組織的2.45±1.60，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖 1。

2.2 miR-455-5p表達水平與臨床特征的關系 不同腫瘤分化程度的CRC患者miR-455-5p表達水平的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤分型、TNM分期、有無淋巴轉移的CRC患者miR-455-5p表達水平的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表 2。

圖1 miR-455-5p在CRC組織及癌旁正常黏膜組織中的相對表達量

2.3 miR-455-5p轉染CRC細胞的結果 將未轉染細胞作為空白組，轉染mimics-NC作為陰性對照組，轉染miR-455-5p mimics作為陽性對照組。結果顯示miR-455-5p表達均能在 SW480、HCT-116、HT-29 細胞上下調(diào)，即轉染成功，陽性細胞比例為70%～80%，見圖2。

2.4 miR-455-5p對CRC細胞增殖的抑制作用 3株轉染后的細胞進行Brdu增殖檢測，結果顯示：下調(diào)miR-455-5p 后，可促進 SW480、HCT-116、HT-29 細胞增殖；上調(diào) miR-455-5p后，可抑制SW480、HCT-116、HT-29細胞增殖，見圖3。

2.5 miR-455-5p對CRC細胞凋亡的促進作用 與inhibitor-NC比較，轉染miR-455-5-inhibitor可抑制SW480、HCT-116、HT-29 細胞凋亡 （均P＜0.05）；與mimics-NC比較，上調(diào)miR-455-5p可促進HT-29、HCT-116細胞凋亡（均P＜0.05），而SW480的凋亡差異不明顯（P＞0.05），見圖4和圖5（插頁）。

表2 miR-455-5p表達水平與臨床特征的關系

圖2 miR-455-5p轉染3株CRC細胞的熒光圖

圖3 miR-455-5p對CRC細胞增殖的抑制作用（*P＞0.05）

2.6 miR-455-5p抑制CRC細胞遷移 HT-29細胞劃痕24h后，與inhibitor-NC比較，抑制miR-455-5p可促進HT-29遷移；與mimics-NC比較，上調(diào)miR-455-5p可抑制HT-29遷移，見圖6。

圖4 流式細胞儀檢測轉染后CRC細胞凋亡情況

圖6 HT-29細胞劃痕結果

2.7 驗證miR-455-5p對PIK3R1表達的影響 為進一步明確miR-455-5p對腸癌細胞增殖的分子機制，通過 Target Scan、miRNA da和 Pic Tar等 3個在線miRNA靶基因預測軟件對miR-455-5p的靶基因進行預測。根據(jù)靶基因預測數(shù)據(jù)庫確定miR-455-5p與靶基因PIK3R1 mRNA 3'UTR的結合區(qū)域。qRT-PCR檢測轉染48h后CRC細胞中PIK3R1的表達，結果顯示：抑制miR-455-5p可促進CRC細胞PIK3R1基因mRNA水平表達；上調(diào)miR-455-5p可抑制CRC細胞PIK3R1基因mRNA水平表達。應用Western bolt法檢測PIK3R1蛋白表達情況，結果顯示：抑制miR-455-5p可促進3株CRC細胞PIK3R1蛋白表達；上調(diào)miR-455-5p可抑制3株CRC細胞PIK3R1蛋白表達，見圖7（插頁）。

3 討論

自從1993年Lee等[4]首次在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種可以調(diào)節(jié)其發(fā)育進程的RNA（lin-4）后，miRNA逐步進入研究者的視野。它是一類內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼的RNA分子，廣泛分布于病毒、植物以及高等哺乳動物中。mRNA的表達即使出現(xiàn)輕微的變化，也會引起mRNA轉錄后水平的變化。因此miRNA是繼轉錄分子之后，又一個具有調(diào)節(jié)作用且與腫瘤存在密切關系的內(nèi)源性調(diào)控分子。CRC的發(fā)生是一個多基因異常的過程，隨著研究的不斷深入，越來越多的分子生物學標志被證實與CRC的發(fā)生有關[11-15]。miR-21是首個在人體體液中發(fā)現(xiàn)的miRNA，Toiyama等[16]通過對比分析186例腸癌組織、43例高級別腺瘤組織及53例正常對照組織，發(fā)現(xiàn)血清miR-21表達水平隨著臨床分期呈階梯狀升高，且其靈敏度和特異度均較高，認為其可作為CRC的篩查指標；該研究還發(fā)現(xiàn)miR-21表達水平可作為影響CRC患者生存的獨立預后因素。Slaby等[17]發(fā)現(xiàn)在CRC組織中，miR-145表達水平明顯下調(diào)，且與腫瘤體積、TNM分期有著臨床相關性，認為miR-145作為抑癌因子在腸癌發(fā)展過程中起著重要作用，尤其是在腺瘤惡變?yōu)橄侔┑倪^程中。miRNA與CRC間的這種關系，為CRC的預防、診斷和治療提供了新的思路。

目前有研究發(fā)現(xiàn)miR-455-5p以抑癌基因的形式存在多種腫瘤中，且呈低表達狀態(tài)；但關于miR-455-5p在CRC的表達及與結腸癌關系的研究并不多。Yang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-455-5p作用癌基因通過靶向調(diào)控galectin-9在結腸癌中發(fā)揮作用。但Yang等[18]的研究入組標本只有10例結腸癌組織，樣本量較少，因此該研究對miR-455-5p在結腸癌中所發(fā)揮的作用并不能完全明確。而本研究擴大樣本量，同時納入CRC癌旁正常黏膜組織來明確miR-455-5p的作用。研究發(fā)現(xiàn)，與正常黏膜組織比較，miR-455-5p在CRC組織中呈低表達。進一步分析患者的臨床特征，發(fā)現(xiàn)miR-455-5p的相對表達量與腫瘤分化程度可能存在相關性，表明不同腫瘤分化程度對患者的診斷、治療及預后有著重要作用，提示miR-455-5p可能參與了CRC的分化過程。

腫瘤的發(fā)生主要由于細胞增殖凋亡的失控。本研究結果顯示，上調(diào)miR-455-5p可抑制CRC細胞的增殖，促進CRC細胞的凋亡，抑制CRC細胞的遷移，這表明miR-455-5p具有抑癌作用。細胞永生化是腫瘤細胞的一大特性，而造成這個特性是由于細胞的增殖和凋亡，過表達miR-455-5p會影響CRC細胞的生長。本研究中miR-455-5p在SW-480中凋亡不明顯的結果，尚不能斷定是miR-455-5p對SW-480細胞凋亡無影響還是miR-455-5p表達量太低所致，有待進一步探討。進一步研究miR-455-5p調(diào)控CRC細胞的增殖和凋亡的可能機制，筆者通過多個靶基因預測數(shù)據(jù)庫找到了miR-455-5p的一個潛在靶基因PIK3R1。PIK3R1是PIK的調(diào)節(jié)亞基p85a，各種信號分子都要與p85a亞基結合才能激活PI3K，而PI3K家族屬于原癌基因，是肌醇與磷脂酰肌的作用激酶[19-20]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K的主要下游效應分子之一，可直接通過磷酸化多種轉錄因子發(fā)揮作用。PIK/Akt信號通路參與調(diào)控多個轉錄因子，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用[21]。PIK在PDK1的輔助下上調(diào)Akt激活信號通路，Akt通過調(diào)控下游mTOR、XIAP、Mdm2等靶蛋白，進而啟動凋亡周期、促進細胞侵襲等生物學行為。已有研究發(fā)現(xiàn)PIK/Akt信號通路在許多腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、結腸癌等腫瘤的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-455-5p可抑制PIK3R1 mRNA和蛋白的表達，進一步證實了PIK3R1基因是miR-455-5p的功能性靶基因，而miR-455-5p是否通過調(diào)控PIK3R1通路來調(diào)控CRC的發(fā)生、發(fā)展有待進一步研究。目前已有研究證實PIK上調(diào)可影響結腸癌的進展[22]。

綜上所述，miR-455-5p在CRC組織中呈低表達，其生物學特性是miR-455-5p具有抑制CRC細胞生長的作用。通過靶基因預測軟件及Western blot實驗證實PIK3R1是miR-455-5p的靶基因之一，而miR-455-5p發(fā)揮抑癌基因的作用機制可能與調(diào)控PIK3R1的表達有關。

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