滋腎降糖丸對糖尿病性骨質疏松大鼠骨密度及骨形態學的影響*

★楚淑芳 趙恒俠 劉德亮 劉雪梅 渠昕 李增英 李金花 劉玲 李惠林*（深圳市中醫院 廣東 深圳 518033）

糖尿病（diabetes mellitus， DM）已成為世界范圍的嚴重危害人們健康的疾病，據國際糖尿病聯盟統計，到2030年，全球將有5.52億人受到糖尿病的困擾。到2030年，全球將有5.52億人受到糖尿病的困擾。目前，我國已成為僅次于印度的糖尿病第二大國［1］。糖尿病性骨質疏松（diabetic osteoporosis， DOP）是一種常見的糖尿病并發癥，其主要癥狀除糖尿病及其他并發癥癥狀之外，還伴有髖部、腰骶部等部位疼痛或持續性肌肉疼痛等表現，并且容易發生骨折。其主要病理改變為單位體積內骨量減少，骨強度減弱、脆性增加等。流行病學資料顯示，在DM患者中，DOP的發病率可達60%［2］，DM是OP發展的一個重要因素［3］。目前DOP的治療，主要以抗骨質疏松藥物治療為主，然而此類藥物治療效果仍存在爭議，且價格昂貴，有些患者對其副作用不能耐受。由此，中藥的抗骨質疏松作用逐漸受到重視。

糖尿病歸屬中醫學“消渴”范疇，而中醫文獻無骨質疏松癥病名，目前多數醫家認為描述較準確者應屬“骨痿”，《丹溪心法》中就有兩者相關性的論述：“消腎，腎虛受之，腰膝枯細，骨節酸疼。”現代醫家通過多年的實驗及臨床研究證明了腎虛、血瘀、痰濕是消渴與骨痿并發的重要病機。中醫藥對于其治療主要是在補益脾腎基礎上合以益氣養陰、活血化瘀通絡之法。滋腎降糖丸是深圳市中醫院自行研發的中藥復方，具有益氣養陰，滋腎壯骨的作用，符合從“腎主骨”理論入手治療骨質疏松。前期研究發現，滋腎降糖丸不僅具有良好的降糖、調脂、提高胰島素敏感性等作用，而且體外研究發現其可發揮多靶點抗骨質疏松作用，但作用機制不明，因此需要對其進一步研究。因此，本課題首先建立DOP的動物模型，進行不同劑量滋腎降糖丸的干預治療，對其骨密度（bone mineral density，BMD）、骨組織形態學進行研究。

1 實驗材料

2月齡SPF級健康雄性Wistar大鼠60只（合格 證 號：44002100006561），體 重 160～190g，購自南方醫科大學實驗動物中心。動物飼養于深圳市疾病預防控制中心SPF級動物房，環境溫度18℃～22℃，自然晝夜節律光照（12h：12h），自由飲水、攝食，環境濕度40%～70%；SPF級大鼠飼料購自廣東省醫學實驗動物中心。

滋腎降糖丸：由深圳市中醫院藥學部制備，組成成分主要有黃芪、生地黃、熟地黃、淫羊藿、五味子、仙茅、仙靈脾、狗脊、鱉甲、龜板等，滋腎降糖丸（批號：粵Z20070085）用溫熱蒸餾水融化，并濃縮成含生藥1g/mL。實驗時用0.5%

羧甲基纖維素鈉配成所需要濃度的混懸液。鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）購自美國Sigma公司。

雙能X線骨密度儀（GE，美國），BX61顯微鏡（OLYMPUS，日本），sp1600硬組織切片機（Leica，德國），Tissue-Tek DRS 2000染色機（SAKURA，日本）。

2 實驗方法

2.1 模型制作與實驗分組 大鼠適應性喂養2周（標準飲食），隨機取10只作為正常對照，余50只為模型組。所有大鼠禁食12h后，造模組按60mg/kg劑量腹腔注射0.2%STZ（稀釋液為0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH值4.5），正常對照組腹腔注射相同量的0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH值4.5）。采用血糖儀測給藥后72h大鼠尾靜脈血糖值，選取空腹血糖＞16.7mmol/L者，普通飼料喂養2周后同樣方法再次測量空腹血糖仍＞16.7mmol/L認為造模成功。造模成功者共30只，隨機分為模型組、中藥高劑量組（3.0g/kg）、中藥低劑量組（1.5g/kg）。加正常組，共4組，每組10只大鼠。造模成功后次日開始治療，治療方案如下。

正常組與模型組予0.5%羧甲基纖維素鈉10mL/kg/天灌胃；中藥高、低劑量組按不同的濃度（中藥高劑量組濃度為3.0g/kg、中藥低劑量組濃度為1.5g/kg）給予10mL/kg/d灌胃。治療療程為3個月。處理結束后行雙能X線檢查。1周后，所有大鼠禁食12h，戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈采血處死，取骨組織固定及-80℃冰箱保存備用。

2.2 骨密度檢測 各組大鼠治療結束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，應用雙能X線骨密度儀及小動物專用軟件檢測分析骨密度，測量參數為雙能電壓41kVp和100kVp，掃描窗寬18cm，掃描速率4.8s/cm，處死前進行全身骨密度、股骨以及腰椎骨密度測量。

2.3 骨硬組織切片及HE染色

2.3.1 硬組織切片 取股骨髁樣本，去除骨膜及軟組織，修整；立即放入4%多聚甲醛溶液中，固定；清水沖洗24h；以75%、85%、95%、100%梯度乙醇脫水；放入無水丙酮以置換組織中的乙醇；以聚甲基丙烯酸甲脂（PMMA）包埋；以硬組織切片機與植入體垂直橫行截面、切片；砂紙磨片至50μm。

2.3.2 HE染色 二甲苯5min，二甲苯3 min，100%酒精30s，100%酒精30s，95%酒精30s，90%酒精 30s，自來水洗 10～30s，蘇木素染色 10～15min，流水洗20秒，1%鹽酸酒精分化切片10s，流水沖洗15min，1%伊紅染色3min，90%酒精30s，95%酒精30s，95%酒精30s，100%酒 精30s，100%酒精30s，100%酒精30s，石炭酸二甲苯30s，二甲苯30s，二甲苯30s，二甲苯30s；中性樹膠封片。

2.4 統計學處理 所得數據應用State12.0軟件進行統計學分析、處理，計量資料數據以均數±標準差表示。計量資料組內比較采用配對t檢驗，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料采用χ2檢驗。各組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較用Bonferroni檢驗。以P＜0.05表示有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠不同部位骨密度（Bone mineral density，BMD）的比較 經單因素方差分析知，各組大鼠全身BMD之間差異有統計學意義（P＜0.05），進一步行Bonferroni檢驗得，正常組與模型組、中藥高劑量組與模型組之間差異有統計學意義（P＜0.05），而中藥低劑量與模型組、中藥低劑量與中藥高劑量之間差異均無統計學意義（P＞0.05）。對于脊柱及股骨BMD，經統計學分析得各組大鼠脊柱BMD之間差異有統計學意義（P＜0.05），經Bonferroni檢驗可知，模型組與正常組，中藥高、低劑量組與模型組之間比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠不同部位BMD（，n=10） g/cm2

表1 各組大鼠不同部位BMD（，n=10） g/cm2

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

分組 全身 脊柱 股骨正常組 0.18±0.014 0.16±0.012 0.18±0.013模型組 0.13±0.008** 0.11±0.007** 0.13±0.013**中藥高劑量組 0.15±0.006▲ 0.12±0.006▲ 0.14±0.005▲▲中藥低劑量組 0.14±0.011 0.13±0.01▲▲ 0.15±0.015▲

3.2 骨硬組織切片HE染色

圖1 各組大鼠股骨硬組織切片（HE染色，×200）

由圖1可以看出，正常組骨小梁分布均勻，排列整齊（圖A）；而模型組骨小梁結構變細，排列疏松，甚至大片區域骨小梁缺失（圖B）；而中藥高劑量組骨小梁分布均勻，排列尚可，骨小梁較模型組粗大、均勻（圖C）；中藥低劑量組骨小梁結構較模型組亦有改善，數目較模型組增多，排列較模型組整齊（圖D）。

4 討論

本課題主要從骨密度、骨組織形態學方面對滋腎降糖丸的抗骨質疏松作用進行了系統研究。現代醫學認為骨質疏松是一種以骨量減少及骨組織微結構退化為主要表現的骨骼代謝疾病，其導致骨強度降低，骨脆性增加，易致骨折［4］。在本實驗研究中，應用DEXA檢測后發現，模型組大鼠骨密度明顯下降（P＜0.05），而經過滋腎降糖丸治療后，DM大鼠的全身、腰椎及股骨骨密度明顯提高（P＜0.05）。

DOP除了骨量減少的因素外，還與骨結構因素和骨內微損傷的數量有關，骨微損傷存在于活體骨中并影響骨組織微結構性質和功能［5］。骨小梁退行性改變與顯微骨折導致了骨小梁結構強度下降，因此骨顯微結構的改變可以更直接地反映骨質疏松情況。在本實驗中，骨硬組織切片HE染色結果則提示糖尿病大鼠骨皮質變薄，骨小梁數目及面積減少，部分斷裂，結構不連續；而經高、低劑量滋腎降糖丸治療后，糖尿病大鼠骨形成明顯活躍，松質骨與皮質骨骨量明顯增加，骨密度升高，同時骨組織形態獲得顯著改善，骨量丟失得到抑制。

本課題以腹腔注射大劑量STZ構建T1DM模型，此種方法誘導的T1DM動物模型已被證實可導致低骨形成，誘導后8～12周可出現骨量減少［6-7］，我們的前期的預實驗通過腹腔注射60mg/Kg 0.2%STZ成功構建T1DM動物模型后，普通飼料喂養8周后檢測血清骨形成及骨吸收標志，測大鼠全身、脊柱及股骨骨密度，行股骨下段HE染色，均證實了此模型可以誘導骨質疏松。成功構建DOP模型后，給予不同劑量滋腎降糖丸治療，經治療3個月后，治療組大鼠骨密度得到明顯改善，，同時骨組織形態獲得顯著改善，骨量丟失得到抑制。Silva等［8］的研究也表明，STZ誘導的T1DM大鼠骨小梁骨密度逐漸喪失，皮質骨生長過早停止，骨整體硬度和強度的降低導致骨干轉動力矩的降低。骨材料強度略有下降也可導致整體骨強度的降低，和非酶膠原交聯增加有關，故得出結論：T1DM短期內占主導作用的是改變骨結構而非骨骼質量。這和我們的研究結論相符合。

滋腎降糖丸是我院自行研發的中藥復方，具有益氣養陰，滋腎壯骨的作用，符合從“腎主骨”理論入手治療骨質疏松。課題組前期研究發現，滋腎降糖丸降糖具有明確的降糖調脂作用，并且能使胰島素敏感性提高，同時還能夠抗氧化，保護血管內皮，降低炎癥因子水平等作用［9-12］。更重要的是，在抗骨質疏松方面，體外研究發現，滋腎降糖丸含藥血清能通過下調人脂肪酸結合蛋白4（Fatty Acid Binding Protein 4， FABP4）及氧化物酶體增殖物激活受體γ2（peroxisome proliferators-activated receptors γ2，PPAR γ2）表達抑制小鼠骨髓間質干細 胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）成脂分化，上調RUNX2和BMP-2基因表達，促進BMSCs成骨分化，從多靶點發揮抗骨質疏松作用［13-14］。而本實驗通過觀察不同濃度滋腎降糖丸對DOP大鼠骨密度及骨組織形態學的影響，從組織形態學角度證明了其抗骨質疏松作用，但對于其具體機制還需要更深入的研究，比如隨著現代生物學的發展，可以應用基因組學、蛋白質組學、代謝組學等系統生物學研究方法對其進行更深入的研究，加之計算機、數學等學科的協助以及生物信息學的不斷發展和完善，給中醫藥復方研究帶來了新的思路和方法。綜上所述，滋腎降糖丸可以提高DOP大鼠的骨密度，改善骨組織形態，從而發揮其抗骨質疏松作用，對于其可能的機制需進一步研究。

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