EGCG和順鉑合用抑制人肺腺癌NCI?H1975細(xì)胞和人肺鱗狀上皮癌NCI?H520細(xì)胞增殖及對(duì)EGFR表達(dá)的影響

黃潔 李承紅 陳實(shí) 鐘金男 劉敏 李發(fā)久

江漢大學(xué)附屬醫(yī)院（武漢市第六醫(yī)院）呼吸內(nèi)科（武漢 430016）

現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)“國(guó)飲”綠茶具有抗衰老、抗氧化、降脂和抑制腫瘤細(xì)胞增殖及腫瘤細(xì)胞遷移的作用［1-3］。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epi?gallocatechin gallate，EGCG）是其藥理學(xué)作用的主要活性成分［4］。最新研究［5-7］發(fā)現(xiàn)，EGCG 具有抗氧化、抗病毒和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。近年發(fā)現(xiàn)，表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號(hào)通路參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)，該信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、增殖和分化［8］。順鉑（Cisplatin）作為一種化療藥物，廣泛的應(yīng)用于包括肺癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤的治療［9］，研究［10-11］證實(shí)，在眾多包括肺癌在內(nèi)的眾多實(shí)體瘤中存在高表達(dá)EGFR，且與順鉑對(duì)腫瘤的敏感性聯(lián)系甚密，其可能是順鉑用于治療晚期非小細(xì)胞肺癌等癌癥的重要作用機(jī)制之一。然而，其并未取得滿意的安全性和有效性。有研究［12-13］顯示，EGCG在動(dòng)物模型中顯示出無(wú)毒性作用、抗突變和抗腫瘤的特性。EGCG可作為腫瘤耐藥性的逆轉(zhuǎn)劑，能夠改善癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性并減輕毒性作用，所以更多的臨床研究更青睞于將EGCG與化療、放療等其他醫(yī)療手段并用來(lái)治療癌癥，具有廣泛的抗非小細(xì)胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）治療前景［14］。目前已經(jīng)有許多關(guān)于以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案的系統(tǒng)評(píng)價(jià)，但尚未有EGCG與順鉑聯(lián)合方案應(yīng)用于NSCLC的體外實(shí)驗(yàn)研究和具體作用機(jī)制的研究的報(bào)道。本研究擬在NSCLC體外癌細(xì)胞上探究EGCG和順鉑聯(lián)合使用對(duì)NSCLC細(xì)胞的增殖和凋亡的分子機(jī)制，為EGCG用于臨床NSCLC治療和耐藥性改善提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑EGCG（規(guī)格10 mg，純度≥97%，貨號(hào)93894，Sigma），順鉑（規(guī)格 25 mg，純度≥ 97%，貨號(hào)P4394，Sigma）、人肺腺癌NCI?H1975細(xì)胞和人肺鱗狀上皮癌NCI?H520細(xì)胞系由武漢大學(xué)生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。Cell Counting Kit?8（CCK?8）試劑盒（碧云天生物有限公司），抗磷酸化EGFR（phospho?EGFR）和 EGFR 多克隆抗體（Protein?tech）。EGFR、β?actin引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 主要儀器電泳儀（美國(guó)Bio?Rad）；RT?qPCR反應(yīng)儀（美國(guó)Bio?Rad）；熒光倒置顯微鏡（日本Olymics）。

1.3 細(xì)胞及其培養(yǎng)NCI?H520和NCI?H1975細(xì)胞株在37 ℃、5%CO2條件下，于10%FBS的RPMI?1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)和傳代。

1.4 EGCG和順鉑不同時(shí)間及濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照每孔2×103個(gè)/孔接種96孔板中，培養(yǎng)6 h貼壁。依次更換含0，20，40，80，160和320 μmol/L的EGCG，0，0.25，0.5，1，2，4和8 μg/mL的順鉑的培養(yǎng)基培養(yǎng)24，48和72 h。每孔加入 CCK?8溶液 10 μL，培養(yǎng)4 h后于450 nm處測(cè)定吸光度（OD）。抑制率=（OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組）/OD對(duì)照組×100%。

1.5 EGCG和順鉑合用對(duì)NCI?H520和NCI?H1975細(xì)胞凋亡的影響按照細(xì)胞數(shù)每孔1×105個(gè)/孔接種6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6 h后，更換為3 mL含2%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h進(jìn)行細(xì)胞同步化；設(shè)置空白組、EGCG、順鉑和EGCG+順鉑組；依照Hoechst 33258染色操作，觀察細(xì)胞核變化。

1.6 EGCG對(duì)NCI?H520和NCI?H1975細(xì)胞中Pt和Pt?DNA結(jié)合物含量的影響采用Tris平衡酚法抽提DNA，并調(diào)節(jié)DNA濃度至100 ng/L后用5%硝酸處理后，用電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測(cè)。

1.7 EGCG和順鉑合用對(duì)NCI?H520和NCI?H1975細(xì)胞Phospho?EGFR和EGFR表達(dá)的影響提取細(xì)胞總蛋白并BCA法檢測(cè)蛋白濃度。干熱變性后，40 μg總蛋白用于Western blot。根據(jù)Image J2X計(jì)算的各條帶灰度的變化，檢測(cè)EGCG和順鉑合用對(duì)細(xì)胞Phospho?EGFR和EGFR蛋白表達(dá)影響。

1.8 EGCG和順鉑合用對(duì)NCI?H520和NCI?H1975細(xì)胞EGFR mRNA表達(dá)的影響Trizol提取細(xì)胞總RNA，RT?PCR逆轉(zhuǎn)錄后取25 ng cDNA作為反應(yīng)模版，20 μL PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后制作融解曲線，以β?actin為內(nèi)參，采用 2?△△Ct法計(jì)算 EGFR mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。產(chǎn)物用含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。EGFR（177 bp）引物序列為 5′?AGGCAC?GAGT?AACAAGCTCAC?3′和 5′?ATGAGGACATA?ACCAGCCACC?3′。β?actin（250 bp）引物序列為5′?CATGT?ACGTTGCTATCCAGGC?3′和 5′?CTCCTTA?ATGTCA?CGCACGAT?3′。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，兩個(gè)樣本均數(shù)用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本間采用完全隨機(jī)的單因素方差分析，檢驗(yàn)水平α為0.05，以P＜0.05作為具有顯著差異的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 不同濃度和作用時(shí)間EGCG及順鉑對(duì)NCI?H520和NCI?H1975細(xì)胞增殖的影響如圖1所示，EGCG與順鉑的抑制作用隨時(shí)間和濃度增加而增強(qiáng)（P＜0.05）。24 h抑制作用最好，分別為：EGCG的濃度為20 μmol/L，順鉑的濃度為4 μg/mL。

圖1 不同濃度及作用時(shí)間EGCG和順鉑對(duì)NCI?H520、NCI?H1975細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 EGCG and Cisplatin inhibit the proliferation of NCI?H520和NCI?H1975 cells at different concentrations and times

2.2 EGCG增強(qiáng)順鉑對(duì)NCI?H520和NCI?H1975細(xì)胞的抑制作用如圖2所示，EGCG與不同濃度的順鉑合用24 h后，相比于順鉑單獨(dú)作用，抑制率顯著增高（P＜0.05），且隨順鉑濃度增加而增強(qiáng)（P＜0.05）。

圖2 EGCG增強(qiáng)順鉑對(duì)NCI?H520 和 NCI?H1975 細(xì)胞的抑制作用Fig.2 EGCG enhanced inhibitory effect of Cisplatin on the proliferation of NCI?H520 and NCI?H1975 cells

2.3 EGCG 對(duì)NCI?H520 和NCI?H1975 細(xì)胞內(nèi)鉑和DNA?鉑加合物含量的影響EGCG與順鉑合用作用細(xì)胞24 h，相比于順鉑單獨(dú)作用，細(xì)胞內(nèi)鉑和DNA?鉑加合物含量明顯增加（P＜ 0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 EGCG和順鉑合用對(duì)NCI?H520和NCI?H1975細(xì)胞凋亡的影響聯(lián)合EGCG與順鉑時(shí)，兩種細(xì)胞的細(xì)胞核固縮明顯，數(shù)量較多，細(xì)胞凋亡增加。見(jiàn)圖4。

圖3 EGCG和順鉑合用提高細(xì)胞內(nèi)順鉑及DNA?順鉑加合物含量Fig.3 The combination of EGCG and Cisplatin increases Pt and DNA?Pt adducts accumulation in the cells

圖4 EGCG和順鉑合用促進(jìn)細(xì)胞凋亡Fig.4 The combination of EGCG and Cisplatin promotes the cell apoptosis

2.5 EGCG和順鉑合用對(duì)NCI?H520和NCI?H1975細(xì)胞EGFR的影響聯(lián)合使用EGCG與順鉑明顯降低細(xì)胞內(nèi)EGFR mRNA和磷酸化EGFR的表達(dá)（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

3 討論

EGFR及其下游分子下調(diào)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡［15-17］。順鉑作為臨床重要的NSCLC治療藥物之一，其敏感性受到EGFR信號(hào)調(diào)節(jié)［18］。研究證實(shí)，順鉑治療效果與EGFR突變密切相關(guān)［19］。因此，聯(lián)合EGCG與順鉑可能在NSCLC治療方面前景廣闊。

圖5 EGCG和順鉑合用明顯降低細(xì)胞內(nèi)EGFR mRNA和磷酸化EGFR的表達(dá)Fig.5 The combination of EGCG and Cisplatin reduces EGFR mRNA and phospho?EGFR expression in the cells

本研究證實(shí)，EGCG能有效抑制人NSCLC細(xì)胞株 NCI?H520 和 NCI?H1975 體外增殖和誘導(dǎo)凋亡，并且與順鉑合用作用增強(qiáng)。為鑒定EGCG的特異性，首先檢測(cè)細(xì)胞中順鉑及DNA?順鉑加合物含量。發(fā)現(xiàn)EGCG明顯誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Pt?DNA復(fù)合體的堆積。提示EGCG可改善人NSCLC細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性降低。考慮加合物通過(guò)阻斷DNA復(fù)制而抑制細(xì)胞增殖［19］，同時(shí)，文獻(xiàn)［6］報(bào)道EGCG影響多種癌細(xì)胞的凋亡。因此，我們進(jìn)一步檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG增強(qiáng)癌細(xì)胞的核固縮。證實(shí)EGCG可能通過(guò)改變DNA促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而EGFR是已知的NSCLC中高突變和高表達(dá)的分子受體，也與細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)［8］。因此本研究亦檢測(cè)了其蛋白和mRNA含量。結(jié)果顯示，EGCG和順鉑合用明顯抑制NSCLC癌細(xì)胞EGFR的磷酸化和mRNA表達(dá)。

綜上所述，EGCG聯(lián)合順鉑的抗NSCLC作用機(jī)制可能通過(guò)下調(diào)EGFR轉(zhuǎn)錄和EGFR磷酸化，抑制DNA合成依賴性的增殖和促進(jìn)凋亡。本課題組曾選取人NSCLC細(xì)胞株NCI?H520和NCI?H1975細(xì)胞作為研究對(duì)象，首次發(fā)現(xiàn)EGCG具有相當(dāng)?shù)捏w外抑制NSCLC效果。同時(shí)又可增強(qiáng)順鉑的殺傷作用和降低其毒性。然而，EGCG是如何上調(diào)EGFR的轉(zhuǎn)錄活性和提高EGFR蛋白磷酸化水平，有待進(jìn)一步證實(shí)，且是否有在體藥理學(xué)效應(yīng)和相似機(jī)制，以及對(duì)EGFR突變NSCLC的作用，仍有待研究。而本研究為將其聯(lián)合順鉑開(kāi)發(fā)成為一種高效低毒的抗腫瘤藥提供了一定的依據(jù)，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

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