PTEN基因在子宮內膜癌細胞上皮間質轉化中的作用

李品瑩 李小毛

中山大學附屬第三醫院（廣州510630）

子宮內膜癌（endometrial cancer）為女性常見的生殖道惡性腫瘤之一，其病因學的分子機制尚未清楚。人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）是至今發現第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因［1］，目前國內外已有實驗證實該基因的突變或缺失及蛋白異常表達與子宮內膜癌、乳腺癌、膠質細胞瘤、前列腺癌、結直腸癌、胃癌等惡性腫瘤的發生息息相關［2-5］，但在PTEN基因成功轉染的子宮內膜癌細胞上是否能抑制其生長，并對子宮內膜癌細胞的上皮間質轉化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）起作用？其關聯性仍待進一步研究。故本研究擬通過轉染抑癌基因PTEN至子宮內膜癌ishikawa細胞系，并檢測CDH1及CDH2蛋白的表達水平，及轉染后的ishikawa?PTEN細胞表面標志物CD133的陽性表達結果，旨在探討PTEN基因在子宮內膜癌細胞EMT中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料子宮內膜癌細胞系ishikawa細胞購于凱基生物公司（Cat No.KG314）。細胞在含滅活的胎牛血清（FBS）、青鏈霉素混和液（8 000 U/mL青霉素、8 mg/mL鏈霉素）的RPMI1640培養基中培養。FItran慢病毒包裝專用轉染試劑、PEG8000慢病毒濃縮液購于輝駿生物公司，微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通質粒小提試劑盒I型購于中美泰和公司。UltraSYBR Mixture（High ROX）購于康為世紀（CW2602M）。HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit購于康為世紀（CW2582M）。引物由艾基生物公司合成。Anti?Human CD133 PE購于杰特偉生物科技公司（8512133841）。所有試劑均于使用當天配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞系和細胞培養子宮內膜癌細胞系ishikawa細胞，PLVX?PURO慢病毒載體轉染后的ishikawa?puro細胞，PLVX?PURO?PTEN慢病毒載體轉染后獲得的ishikawa?PTEN細胞。所選用的培養基為RPMI1640完全培養基（RPMI1640＋10%小牛血清），置于5%CO2、37℃、95%相對濕度的培養箱內培養。

1.2.2 293T細胞準備取出凍存于液氮中的293T細胞，37℃水浴融化后將293T細胞接種于25 cm2的培養瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培養基，置于5%CO2、37℃、95%相對濕度的培養箱內培養。待細胞長成均勻的單層細胞且達到90%以上的聚集度時傳代，先將培養基吸出再加入500 μL 0.25%胰蛋白酶，在室溫下消化，并于顯微鏡下觀察，當細胞呈現皺縮且變圓時立即加入DMEM培養基，并反復的吹打培養基使其成細胞懸液，于血球計數板計數，以含10%小牛血清的DMEM培養基調整細胞密度后，再接種于10 cm細胞培養皿，約5×106cell/皿（共10 mL完全培養基），置于5%CO2、37℃、95%相對濕度的培養箱內培養。24 h后，待細胞密度達到80%時可用于分盤至150 mm的細胞培養盤。

1.2.3 慢病毒包裝（1）包裝當天（分皿24 h后），將293T細胞換成20 mL的無抗DMEM培養基+10%FBS+4 mmol/L Gln，置于5%CO2、37 ℃、95%相對濕度的培養箱中培養2 h。27 μg的GSTM5慢病毒質粒及2個輔助質粒，加入1 mL的生理鹽水中輕輕混合，靜置5 min后加入3倍質粒量的轉染試劑Polyethylenimine，靜置于室溫下孵化20 min后，慢慢滴入150 mm培養皿中，輕柔搖勻，此時間點標記為轉染開始。經過6 h的轉染后換液，吸取適量的PBS輕柔漂洗細胞2次，換上DMEM培養基 +10%FBS+4 mmol/L Gln，1%P/S培養基。

1.2.4 病毒收集于轉染后的第48小時及第72小時分別收集上清液，以1 000 r/min離心5 min，用0.45 μm微孔濾器過濾上清液。以4℃，50 000g超高速冷凍離心機高速離心2 h，棄上清液，用1 mL PBS充分溶解病毒沉淀，最后以0.22 μm微孔濾器過濾，分裝為100 μL/管，濃縮液保存于-80℃冰箱。

1.2.5 ishikawa細胞傳代鋪板將RPMI1640完全培養基、Trypsin?EDTA和PBS預先回溫置室溫。倒去培養皿中的培養液，PBS洗滌細胞2次，將殘余的血清去除。倒去PBS后加入適量的Trypsin?EDTA，輕柔震蕩，使Trypsin?EDTA均勻覆蓋至培養器皿表面，消化約1 min后放至顯微鏡下見細胞變圓且間隙增大后，加入2 mL的RPMI1640完全培養基終止消化。吸取培養器皿內的液體，輕柔反覆吹打器皿表面，使細胞完全脫離器皿壁后，將細胞移入離心管中，以1 000 r/min離心5 min后，除去上清液，再加入5 mL DMEM完全培養基，反復吹打培養基使其成細胞懸液，取少量樣本計數。按照計數的結果，以0.5×106cells/孔的密度接種到6孔板，總共接種3個孔。

1.2.6 ishikawa細胞感染待ishikawa細胞完全貼壁密度達50%后進行感染。于感染前，在每孔細胞更換為1 000 μL新鮮的無雙抗DMEM完全培養基10 μg/mL polybrene，放置于培養箱孵育1 h。于其中一孔加入100 μL的PTEN病毒，標記為ishikawa?PTEN；另一孔加入100 μL的對照慢病毒，標記為ishikawa?puro；還有一孔細胞做為空白對照組，搖勻后置于5%CO2、37℃、95%相對濕度的培養箱中培養。侵染6 h后，將孔內的培養基吸走，換為RPMI1640完全培養基，置于35%CO2、37℃、95%相對濕度的培養箱中培養。48 h后，傳代細胞，收樣做Q?PCR。

1.2.7 QPCR檢測CDH1、CDH2的mRNA表達水平用Trizol試劑提取ishikawa細胞的總RNA。取10 μL RNA用HiFiScript試劑盒合成第一條cDNA鏈。PCR引物由Primer premier 5.0軟件設計（表1），以GADPH條帶為內參照。PCR反應條件為：42℃孵育15 min，85℃孵育5 min，再進行40個以下循環98℃ 10 min，98℃ 15 s，60℃ 34 s（采集熒光信號）。循環結束后由60℃升高至98℃獲取熔解曲線。

表1 PCR引物Tab.1 Degenerate primer of GADPH、CDH1 and CDH2

1.2.8 CD133表面標志物檢測由ishikawa?puro組中取一小部分細胞到另一EP管，不加CD133抗體，作為空白對照組（Control），于ishikawa?PTEN組和 ishikawa?puro組內各加入 5 μL CD133 抗體，避光孵育30 min，1 000 rpm/min離心5 min，PBS洗滌2遍。加入500 μL PBS重懸，流式細胞儀檢測CD133表面標志物陽性率。

1.3 統計學方法以SPSS 13.0軟件進行數據分析，數據資料以均數±標準差表示，采用方差分析進行相關性分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CDH1、CDH2的mRNA在ishikawa細胞中的表達水平于不同的樣本中，為了在待測基因中體現出差異表達，需將實驗誤差及樣本量等因素均一化，故藉由內參基因的Ct值來平衡實驗差，再以△△Ct值計算基因表達倍數參的差別，計算見表2、3。結果顯示，ishikawa?PTEN細胞的CDH1 mRNA表達量為ishikawa?puro細胞的0.62倍（圖1）；ishikawa?PTEN細胞的CDH2 mRNA表達量為ishi?kawa?puro細胞的2.07倍（圖2），兩組數據相比差異具有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表2 CDH1的mRNA在ishikawa細胞的表達水平數據分析Tab.2 Data Analysis：The mRNA of ishikawa?puro and ishikawa?PTEN CDH1

圖1 CDH1 mRNA表達量比較圖Fig.1 The comparison of CDH1 mRNA

圖2 CDH2 mRNA表達量比較圖Fig.2 The comparison of CDH2 mRNA

2.2 CD133 表面標志物在 ishikawa?puro 與 ishi?kawa?PTEN中的陽性表達情況ishikawa?puro組與ishikawa?PTEN組比較CD133抗體陽性表達率，ishikawa?PTEN 組較 ishikawa?puro組有減少的趨勢（表5），流式分析結果如下：空白對照組見圖3、ishikawa?puro組見圖4、ishikawa?PTEN組見圖5。

3 討論

惡性腫瘤的主要特點為局部浸潤與遠處轉移，這也是惡性腫瘤預后不良的主要原因，研究惡性腫瘤的局部浸潤及轉移機制對于治療腫瘤具有重要意義。研究指出EMT在惡性腫瘤的局部浸潤與遠處轉移均有著重要聯系［6］。

EMT最開始是在哺乳動物胚胎的發育過程被發現，原始中胚層的形成、神經脊發育成體節和肌肉等組織均涉及到EMT的過程。EMT為上皮細胞在一定條件下向間質細胞轉化的過程，在增加腫瘤細胞侵擾轉移機會的同時，也使得腫瘤細胞具有自我更新能力等腫瘤干細胞的特性［7］。首先細胞表面上皮標志物表達下調及間質標志物表達上調，使得上皮細胞失去細胞極性，細胞間的連接斷裂，肌動蛋白骨架開始重組，之后便伴隨著細胞黏附能力的下降，胞外基質金屬蛋白酶（MMPs）表達增加，使細胞更容易離開所在部位［8］。EMT過

程中參與的標志物有許多，包括上皮標志物：CDH1（E?鈣黏蛋白）、細胞角蛋白等；間質標志物：CDH2（N?鈣黏蛋白）、波形蛋白（Vimentin）、α平滑肌肌動蛋白（α?SMA）等［9-10］。

表3 CDH2的mRNA在ishikawa細胞的表達水平數據分析Tab.3 Data Analysis：The mRNA of ishikawa?puro and ishikawa?PTEN CDH2

表4 CDH1、CDH2 mRNA表達水平數據統計學分析Tab.4 Statistical Analysis：The mRNA of ishikawa?puro and ishikawa?PTEN CDH1,CDH2

表5 CD133表面標志物陽性表達情況Tab.5 The expression rate of CD133

圖3 空白對照組CD133表面標志物陽性表達情況Fig.3 The expression rate of CD133 in Control

圖4 ishikawa?puro細胞組CD133表面標志物陽性表達情況Fig.4 The expression rate of CD133 in ishikawa?puro

圖5 ishikawa?PTEN細胞組CD133表面標志物陽性表達情況Fig.5 The expression rate of CD133 in ishikawa?PTEN

鈣黏蛋白是鈣依賴性跨膜糖糖蛋白，介導上皮組織中的細胞連接，借以維持組織極性及完整性。鈣黏蛋白按分布及結構主要可分為：E?鈣黏蛋白，P?鈣黏蛋白，N?鈣黏蛋白，而E?鈣黏蛋白轉化為N?鈣黏蛋白的過程被認為是腫瘤EMT機制的關鍵步驟［11-12］，研究顯示，EMT的過程中均持續存在著E?鈣黏蛋白的低表達或缺失［13-14］。

CD133為Prominin家族成員，是分子量為120 kD的細胞表面跨膜糖蛋白，由865個氨基酸組成，在間質干細胞，內皮祖細胞等細胞中均發現有特異表達［15］。CD133表達陽性細胞與多種腫瘤干細胞有相關性，其具有腫瘤惡性表型及浸潤能力等腫瘤干細胞的生物學特性［16-17］，為目前公認的腫瘤干細胞表面標志物。NAKAMURA等［18］分離ishikawa細胞中CD133陽性的細胞并對其進行檢測，發現CD133陽性的細胞具有更強的克隆能力、化療耐受力及體外致瘤性。

本實驗采用QPCR及流式細胞術對ishikawa?PTEN細胞中的CDH1、CDH2、CD133進行研究，結果顯示，ishikawa?PTEN細胞的CDH1 mRNA表達量低于 ishikawa?puro細胞的表達量，ishikawa?PTEN細胞的CDH2 mRNA表達量則高于ishikawa?puro細胞的表達量，又CDH1向CDH2轉化的過程被認為是EMT的關鍵步驟，且CDH1的低表達或缺失持續存在于EMT過程中，此結果提示了PTEN基因在抑制子宮內膜癌細胞向腫瘤干細胞轉化的EMT中具有重要的作用。在CD133陽性表達率檢測方面，ishikawa?PTEN細胞的陽性表達率比ishikawa?puro細胞低，鑒于CDl33表達陽性細胞具有腫瘤干細胞的生物學特性，此結果說明了PTEN基因對降低子宮內膜癌細胞的惡性表型及浸潤能力起一定作用。

綜上所述，PTEN基因與CDH1、CDH2、CD133均具有相關性，PTEN基因的缺失，可導致子宮內膜癌細胞EMT的發生，促進子宮內膜癌的侵擾轉移，從而使子宮內膜癌患者的生存受到影響。檢測PTEN基因可用于預測子宮內膜癌患者的腫瘤轉移及術后復發風險，亦可為判斷子宮內膜癌的惡性程度及預后提供重要的依據。進一步探討子宮內膜癌細胞與PTEN的相互作用及其機制，將為進一步了解子宮內膜癌干細胞的生物學特性及子宮內膜癌的靶向治療打開新的局面。

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