右美托咪定預給藥對切口痛大鼠脊髓膠質細胞的影響

肖凡 羅振中 盧俊 陳受琳 黃丹 周斌 陳琴琴 華福洲

南昌大學第二附屬醫院麻醉科（南昌 330000）

膠質細胞激活對急性疼痛的產生和維持起關鍵作用。脊髓背角的膠質細胞被認為參與了疼痛反應［6］。脊髓的膠質細胞主要是小膠質細胞和星形膠質細胞。其在神經系統功能中都扮演著重要作用，參與免疫反應和炎癥反應［7］。近年來脊髓膠質細胞在切口痛中的作用引起廣泛關注，外周組織損傷、手術損傷、炎癥和神經損傷等因素都可以激活脊髓膠質細胞。脊髓膠質細胞的激活不僅與術后機械痛敏的產生和維持有關，而且與異常性疼痛、痛覺過敏的產生和維持密切關系［1］。有研究表明抑制膠質細胞的激活可以阻斷痛覺過敏狀態。圍術期使用麻醉鎮痛藥如氯胺酮及七氟醚等均可不同程度地抑制膠質細胞的激活［2］。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是高選擇性α2?腎上腺素受體激動劑，研究證實具有鎮痛作用［3］。然而右美托咪定對切口痛的影響及與膠質細胞的關系目前仍不清楚。本研究通過建立大鼠切口痛模型，觀察右美托咪定對脊髓膠質細胞OX42、GFAP及炎性因子表達的影響，來探討右美托咪定在切口痛中的作用，從而為減輕切口痛的發生和發展提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料右美托咪定（批號：H20100250，江蘇恒瑞醫藥公司），小鼠抗大鼠OX42多克隆抗體（GBP公司，美國），兔抗大鼠GFAP多克隆抗體（UCL公司，美國），Real Eevision二抗檢測系統（TECH公司，美國），von Frey纖維絲（Stolting公司，美國）。

1.2 實驗分組清潔級健康成年雄性SD大鼠，體重200～220 g，取大鼠60只，隨機分為4組（n=15）：S組為假手術組，O組為手術對照組，D1、D2組分別為低劑量及高劑量右美托咪定組。O組、D1組和D2組大鼠行左后足切開術制備切口痛模型，D1、D2組于術前10 min分別腹腔注射右美托咪定 30 μg/kg及 50 μg/kg［3］。S組和O組腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 大鼠切口痛模型的建立大鼠后爪趾部切口疼痛模型建立：參考BRENNAN［4］的方法，在吸入1.4%異氟醚麻醉（假手術組同等麻醉）平穩后，用碘伏消毒大鼠右后爪，在足趾面用11#刀片從距足跟0.5 cm處向足趾部作一長約1 cm的縱形切口（略微旁開正中線），依次切開皮膚和筋膜，用眼科鑷挑起足底肌肉并縱向切割，但保持肌肉起止和附著的完整性，輕壓止血后用5-0尼龍線縫合2針以縫合皮膚，切口局部涂抹抗生素軟膏預防感染。手術結束后置入飼養籠，單獨飼養，保持飼養環境一致：室溫維持在20～25℃，正常晝夜節律，無強光和強噪聲刺激，自由飲水和攝食。

1.4 術后行為學觀察于建立后爪趾部切口疼痛模型的術前（T0）、術后2、6、12、24 h（T1-4）分別觀察機械縮足反射閾值（MWT）。MWT測定：按CHAPLAN法［5］應用von Frey纖維絲測定大鼠右后足的機械縮足反射閾值。大鼠置于底部為金屬絲網格的實驗籠中，用一套應力不同并標有刻度的von Frey纖維絲垂直刺激大鼠右后足掌底部靠近切口的區域，維持纖維絲輕度彎曲4～6 s或在大鼠出現行為反應如縮足、逃避或舔足時停止刺激。從2.0 g的纖維絲開始，最大值為15.0 g，超過此值記為15.0 g，以up?down法推測閾值，在閾值上下各刺激5次，用內推算法算出50%反應閾值。每次刺激至少間隔15 s，并需等刺激引起的行為反應完全消失后再給予下一次刺激。

1.5 Western blot行為學實驗結束后，各組取3只大鼠應用Western blot方法測定脊髓小膠質細胞標記物（OX42）和星形膠質細胞標記物（GFAP）的表達水平。在吸入1.4%異氟醚麻醉平穩后，將大鼠置于冰上，快速取出L4-6脊髓后放入2 mL凍存管中，再迅速存入液氮中。脊髓組織按照1 mL/100 mg比例加入裂解液，制成勻漿，離心取上清液，采用BSA法進行蛋白定量。取等量樣品進行SDS?PAGE電泳，轉移至PVDF膜，將膜分別與一抗室溫下孵育，再與辣根過氧化物酶標記二抗室溫下孵育，將膜與ECL發光底物接合，膜與膠片在暗室結合曝光、顯影、成像。所得結果掃描后用進行定量分析，以目的蛋白灰度值與內參照β?actin灰度值的比值表示OX42和GFAP蛋白的表達。

1.6 脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量的測定取出脊髓后，迅速冷凍、稱重，加入預冷的含蛋白酶抑制劑的磷酸鹽緩沖液手動勻漿，4℃下離心20 min后取上清液備用。采用ELISA法測定脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量的測定。

1.7 統計學方法采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，組內及組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組大鼠不同時點MWT值比較四組大鼠T0時MWT值比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與S相比，O組大鼠T1-3時MWT值均下降（P＜0.05）；與O組相比，D1、D2組大鼠T1-3時MWT值均升高（P＜0.05）；與D1組相比，D2組大鼠T1-3時MWT值差異無統計學意義。見表1。

2.2 四組大鼠脊髓OX42及GFAP表達比較與S組相比，O組脊髓OX42表達上調（P＜0.05），脊髓GFAP表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與O組相比，D1、D2組脊髓OX42的表達表達下調（P＜0.05），脊髓GFAP表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

2.3 四組大鼠脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量比較與S組相比，O組脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量升高（P＜0.05）。與O組相比，D1、D2組脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量下降（P＜ 0.05）。見表2。

表1 四組手術前后MWT比較Tab.1 Compaerson of MWT before and after operation of four groups（n=15） x ± s，g

圖1 四組大鼠脊髓OX42及GFAP表達水平（n=6）Fig.1 Expression level of OX42 and GFAP in spinal cord for the four groups

表2 四組大鼠脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量Tab.2 Levels of IL?1β，IL?6 and TNF?α in spinal cord for the four groups（n=3） x ± s，pg/mg

3 討論

本實驗采用的大鼠后爪趾部切口痛模型是經典的急性疼痛模型［4］。目前認為右美托咪定主要通過增加神經電刺激的閾值、減慢神經刺激的傳播和減少動作電位的升高率來阻滯神經刺激的產生和傳導。有研究［5］證實右美托咪定不僅可以阻斷手術時疼痛的產生，而且可以較長時間影響機械痛敏，減少術中及術后阿片類藥物用量。本研究行為學研究結果顯示，腹腔注射右美托咪定可提高疼痛痛閾，減輕大鼠機械痛敏。

膠質細胞激活對急性疼痛的產生和維持起關鍵作用。脊髓背角的膠質細胞被認為參與了疼痛反應［6］。脊髓的膠質細胞主要是小膠質細胞和星形膠質細胞。其在神經系統功能中都扮演著重要作用，參與免疫反應和炎癥反應［7］。近年來研究［8-9］表明，脊髓小膠質細胞和星形膠質細胞與疼痛調制密切相關。OX42和GFAP分別是小膠質細胞和星形膠質細胞激活的特異性標志物［10］。在疼痛反應中，目前認為小膠質細胞往往首先被激活，活化的小膠質細胞再作用于相鄰的星形膠質細胞，可導致慢性痛疼反應［11］。脊髓小膠質細胞的激活往往發生在疼痛發展的早期階段，短暫且反復存在［12］；而星形膠質細胞的激活較晚且持久。本研究結果表明切口痛在大鼠脊髓背角OX42的表達上調，而GFAP卻沒有明顯變化，這提示急性疼痛與脊髓小膠質細胞激活有關；但筆者未發現星形膠質細胞明顯活化，可能與本實驗選擇的實驗指標的檢測時間有關。LIU等［13］研究也發現，在術后切口痛的后期中星形膠質細胞顯著活化，可能與研究指標的檢測時間在術后第3天相關。腹腔注射右美托咪定30 μg/kg及50 μg/kg均可抑制急性疼痛導致的小膠質細胞活化，但該劑量的變化無明顯差異，提示我們的實驗還有待改進。

脊髓小膠質細胞激活后，其釋放大量的細胞因子、炎性介質和神經活性物質，如 IL?1、IL?6、TNF?α等，而這些物質又可反作用于脊髓小膠質細胞擴大疼痛反應，形成正反饋，導致炎癥過度反應［14］。右美托咪定可通過抑制膠質細胞的炎性反應，干預中樞炎癥［15］。本研究結果表明大鼠術后脊髓小膠質細胞IL?1β、IL?6和TNF?α含量明顯提高，而右美托咪定預給藥后可降低炎癥因子的分泌，提示右美托咪定可以通過抑制脊髓小膠質細胞的激活而降低了IL?1β、IL?6和TNF?α的分泌。

綜上所述，切口痛急性期脊髓小膠質細胞參與急性疼痛的發生發展；而右美托咪定可以通過抑制脊髓小膠質細胞激活而減輕急性疼痛狀態。在急性痛模型中右美托咪定抑制脊髓膠質細胞的作用機制還有待進一步研究。

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