血紅蛋白Bart′s水腫胎兒綜合征誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系的建立

冼業(yè)星 嚴(yán)金梅 陳玉嫦 李東至 孫筱放

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東省普通高校生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗室（廣州510150）；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，產(chǎn)前診斷中心（廣州 510623）

地中海貧血（thalassemia，簡稱地貧）又稱海洋性貧血，是臨床常見的一組珠蛋白生成障礙性常染色體隱性遺傳性疾病。因其最早在意大利、希臘、馬耳他等地中海沿岸國家發(fā)現(xiàn)而得名，該種疾病在東南亞、地中海等地區(qū)較為常見。根據(jù)珠蛋白基因缺陷的不同分類，而以α地中海貧血和β地中海貧血兩種分型最為常見。其中α-地中海貧血是一組以珠蛋白合成減少，α-鏈/非α-鏈比例失衡為特征的遺傳性溶血性血紅蛋白病。在我國南方α-地中海貧血的高發(fā)區(qū)中，廣西、廣東、江西、四川和浙江各省的發(fā)病率分別為14.95%、4.11%、2.6%、1.92%和1.20%［1］。雖然產(chǎn)前診斷技術(shù)飛速發(fā)展，但是我國每年仍有不少的α-地貧患兒出生。血紅蛋白 Bart′s（Hb Bart′s）水腫胎兒綜合征是a-地中海貧血純合子型，是罕見的新生兒或胎兒嚴(yán)重溶血的致死型，自1960年起國內(nèi)外就開始有陸續(xù)報道［2］。正常人有4個α基因，即αα/αα，當(dāng) 4 個α基因缺失時??/??即為Hb Bart′s胎兒水腫綜合征。最常見的缺失型如東南亞缺失型（??SEA）全部缺失了兩個α基因，即當(dāng)一對夫婦均為此型時，則胎兒有1/4機(jī)會遺傳有Bart氏綜合征風(fēng)險。患者在胎兒時期就出現(xiàn)了大量γ鏈合成γ4，因其對氧的親合力極高，導(dǎo)致組織缺氧而造成胎兒水腫綜合征，孕婦常在妊娠30～40周時便出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎或者胎兒在娩出后30 min內(nèi)死亡。東南亞缺失等位基因在華南地區(qū)人群中達(dá)4%～8%，而在泰國北部甚至高達(dá)14%［3-4］。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）技術(shù)在2006年［5］出現(xiàn)，并在近幾年發(fā)展迅速，為再生醫(yī)學(xué)研究提供了一個理想的研究及治療模型。近年來，科學(xué)家們利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的特性來進(jìn)行向各種體細(xì)胞的分化以探討疾病發(fā)病機(jī)制和治療，如神經(jīng)細(xì)胞和造血細(xì)胞等［6-7］。而目前通過使用Hb Bart′s胎兒水腫綜合征疾病來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞作為材料進(jìn)行該病相關(guān)機(jī)制及治療研究尚未報道，因此本研究通過收集Hb Bart′s胎兒水腫綜合征孕婦羊水細(xì)胞，利用仙臺病毒來誘導(dǎo)建立誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系，評估相關(guān)干細(xì)胞多能性，為下一步治療研究提供理想的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑細(xì)胞培養(yǎng)皿、15/50 mL離心管和凍存管（Corning），羊水培養(yǎng)基（AmnioMAX?TM?Ⅱ），PCR擴(kuò)增試劑盒（北京天根），Knockout DMEM培養(yǎng)液、Knockout血清替代培養(yǎng)物、NEAA、GlutamaxTM 和 P/S（GIBCO），bFGF（Peprotech），Cy?toTune??iPS 2.0 Sendai重編程試劑盒（Life）、Trizol試劑（Invitrogen），PBS，mTeSR1（Stem cell），EDTA，胰酶，TritonX?100，DAPI染液（ROCHE），AP 染色試劑盒（上海斯丹賽），實(shí)驗用引物（上海捷瑞），抗體OCT4、SSEA4、TRA?1?81、SMA和AFP（Abcam），抗體SOX2、Nestin（ABGENT）。

1.2 儀器與設(shè)備激光共聚焦顯微鏡、倒置顯微鏡和體視顯微鏡（Nikon），臺式離心機(jī)（Eppendorf），恒溫水浴箱（Memmert），生物安全柜、移液槍、培養(yǎng)箱和-80℃冰箱（Thermo），PCR儀（ABI），電泳儀和凝膠成像分析儀（Bio?Rad），液氮罐（MVE），4/-20℃冰箱（Haier）。

1.3 羊水細(xì)胞的采集和培養(yǎng)胎兒診斷為純合性α-地中海貧血（??SEA/??SEA）的孕婦獲得知情同意之后，在妊娠16周時在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行羊膜穿刺術(shù)，抽取10 mL羊水，通過1 000 r/min離心5 min收集羊水細(xì)胞。棄上清，將細(xì)胞懸浮于4 mL羊水培養(yǎng)基中，將其轉(zhuǎn)移至6 cm培養(yǎng)皿中放置于含有5%CO2的37℃潮濕的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7～8 d后更換4 mL新鮮的培養(yǎng)基。在細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，使用適量0.05%胰蛋白酶進(jìn)行消化，并以1∶4的比例傳代到相對應(yīng)的培養(yǎng)皿中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.4 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞建系筆者使用CytoTune??iPS 2.0仙臺重編程試劑盒通過仙臺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將四種轉(zhuǎn)錄因子 OCT4，SOX2，KLF4 和 c?Myc（OSKM）轉(zhuǎn)入血紅蛋白Bart′s患者羊水細(xì)胞中。如圖1所示，轉(zhuǎn)導(dǎo)24 h后更換新鮮羊水培養(yǎng)基，后每隔一天更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)導(dǎo)后第7天時將其消化接種到提前準(zhǔn)備滅活的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）飼養(yǎng)層上。第8天后開始換液更換為新鮮的iPS培養(yǎng)基，以后每天更換新鮮的iPS培養(yǎng)基培養(yǎng)，并觀察克隆形成。待克隆長大后以機(jī)械切割的方式將其傳代擴(kuò)增，將得到的克隆吸到用matrigel覆蓋的無菌培養(yǎng)皿中用mTeSRTM1繼續(xù)培養(yǎng)，前1～3代時待克隆長大后以機(jī)械切割的方法傳代擴(kuò)增以去除分化的細(xì)胞，得到純化的iPSc后可使用EDTA進(jìn)行消化傳代擴(kuò)增及凍存。

1.5 iPSC多能性檢測

1.5.1 堿性磷酸酶檢測將細(xì)胞按1∶6～7比例傳代以稀釋細(xì)胞密度，4～6 d后使克隆長大后克隆之間有足夠間距以便于染色觀察。細(xì)胞足夠大后用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定10 min。再用PBS洗滌3次，加入堿性磷酸酶染色液在室溫下避光孵育30 min。最后用PBS洗滌顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色細(xì)胞系使用4孔板上培養(yǎng)3～4 d后用4%多聚甲醛固定20 min，然后用PBS洗滌2次，使用透膜液0.1%的TritonX?100透膜20 min，加2%FBS?PBS室溫封閉1 h。用PBS洗滌細(xì)胞，細(xì)胞與混有OCT4（1∶200）、SSEA4（1∶100）、SOX2（1/100）和TRA?1?81（1∶200）的一抗在4 ℃下孵育過夜后，用PBS清洗3遍，再與相應(yīng)二抗在37℃下避光孵育2 h，用PBS清洗3遍后用DAPI染細(xì)胞核，共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光拍照。

1.5.2 RT?PCR檢測多能性基因表達(dá)使用Trizol提取已建成的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT?PCR檢測誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞中胚胎干細(xì)胞標(biāo)志性基因SOX2、NANOG、LIN28和OCT4的表達(dá)情況，用胚胎干細(xì)胞H1細(xì)胞系作為陽性對照，羊水細(xì)胞作為陰性對照。PCR反應(yīng)程序設(shè)置：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)擴(kuò)增36次，最后72℃延伸7 min，得到的PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.5.3 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞擬胚體形成實(shí)驗誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞經(jīng)1 g/L的Dispase消化成細(xì)胞團(tuán)塊后，用擬胚體分化液重懸，鋪在低吸附的培養(yǎng)皿中，放置在37℃繼續(xù)懸浮培養(yǎng)，隔天換液，觀察擬胚體形成情況。1周后將擬胚體轉(zhuǎn)移到0.1%明膠包被的細(xì)四孔板胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。1周后，進(jìn)行免疫熒光化學(xué)染色，其中外胚層的標(biāo)記物為Nestin，中胚層的標(biāo)記物為SMA，內(nèi)胚層的標(biāo)記物為AFP，在共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光拍照。

1.5.4 免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成試驗檢測iPSCs的體內(nèi)分化潛能當(dāng)在matrigel包被的無菌培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的iPSCs生長至70%的密度時，用dispase消化酶消化7 min，用1 mL槍頭將細(xì)胞團(tuán)吹脫，用約100 μL的DMEM/F12和Matrigel混合液（1∶1）重懸細(xì)胞，在每只免疫缺陷性（SCID）小鼠的后大腿內(nèi)側(cè)下注射收集的細(xì)胞106個細(xì)胞，大約8～10周后，當(dāng)小鼠腿部的腫塊直徑超過2 cm時處死小鼠分離腫塊。腫塊在福爾馬林中固定過夜，石蠟包埋并進(jìn)行切片，使用蘇木精伊紅（HE）染色，最后顯微鏡下觀察3個胚層的形成情況并拍照記錄。

1.6 核型分析取傳代后3～4 d的iPSCs，加入0.25 mg/L秋水仙素，37℃孵育3 h。用0.05%胰酶把iPSCs消化成單細(xì)胞，1000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，0.4%枸櫞酸鈉：0.4%KCl=1∶1的低滲液37℃下處理5 min；加入7滴新鮮配制的固定液（甲醇：冰醋酸=3∶1）進(jìn)行預(yù)固定，1 000 r/min離心5 min，棄上清，再加固定液，室溫繼續(xù)固定40 min；離心棄上清，加入200 μL的固定液后重懸細(xì)胞，進(jìn)行滴片，使用吉姆薩染色10 min，用水輕輕沖洗，在室溫下風(fēng)干，在顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)SCA3皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)后11～14 d出現(xiàn)胚胎干細(xì)胞樣克隆（圖2B）。轉(zhuǎn)導(dǎo)后第21～22天（圖2C），克隆足夠大時，在顯微鏡下用機(jī)械法將獨(dú)立克隆切開，選擇典型的克隆挑取至鋪有matrigel的4孔板中，每個克隆接種到1個孔內(nèi)并用mTeSRTM1培養(yǎng)基培養(yǎng)，并記作P1代。適量擴(kuò)增及凍存各個代次細(xì)胞。Hb Bart′s水腫胎誘導(dǎo)多能干細(xì)胞形態(tài)特征（圖2D）與人胚胎干細(xì)胞相似，細(xì)胞克隆呈扁平、致密，邊界明顯，核質(zhì)比例較大。

圖1 羊水細(xì)胞重編程示意圖Fig.1 Flow chart of amniotic fluid cell reprogramming

圖2 重編程前后細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Cell morphology before and after reprogramming

2.2 Hb Bart′s水腫胎誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPSCs保留多能性及體外分化潛能本研究建立誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞堿性磷酸酶染色呈陽性（圖3），表明誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)高水平的堿性磷酸酶。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行多能干細(xì)胞的標(biāo)志物SSEA4，TRA?1?81，SOX2和OCT4均陽性，DAPI為核染顯示藍(lán)色熒光（圖4）。

圖3 堿性磷酸酶染色（Bar=100 μm）Fig.3 Alkaline phosphatase staining（Bar=100 μm）

圖4 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞多能性表面特異性標(biāo)志物Fig.4 Pluripotent surface?specific markers of iPS

RT?PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)多能干細(xì)胞表達(dá)人胚胎干細(xì)胞多能性標(biāo)志基因SOX2、NANOG、LIN28和OCT4（圖5）

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞通過自發(fā)分化形成擬胚體（圖），并可形成表達(dá)Nestin（外胚層，圖6A）、SMA（中胚層，圖6B）和AFP（內(nèi)胚層，圖6C）3個胚層。

圖5 RT?PCR 檢測細(xì)胞系中 SOX2、NANOG、LIN28和OCT4基因表達(dá)Fig.5 Detection of the gene expression of SOX2，NANOG，LIN28 and OCT4 in cell lines by RT?PCR

圖6 三胚層分化Fig.6 Differentiation of three germ layer

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞注射到免疫缺陷小鼠8～10周后發(fā)現(xiàn)腹股溝處出現(xiàn)腫瘤。對畸胎瘤組織進(jìn)行切片并HE染色表明，所形成的腫瘤存在包括有外胚層、中胚層和內(nèi)胚層三個胚層分化的組織（圖7）。

此外，筆者還對誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行核型分析（圖8），其在體外長期培養(yǎng)后仍能維持正常的二倍體核型。

3 討論

近幾年誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）技術(shù)的迅速發(fā)展，為再生醫(yī)學(xué)研究提供了獲得病人自身體細(xì)胞來源的多能性干細(xì)胞的體外培養(yǎng)途徑，不但避免了外源細(xì)胞引起自身免疫排斥問題，而且規(guī)避了臨床上的倫理問題。經(jīng)過科學(xué)家們這幾年的研究，已經(jīng)成功建立起多種疾病病人特異性的iPS細(xì)胞系［8］。正是iPSc技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們逐漸將其應(yīng)用到疾病治療方向上，如應(yīng)用這種技術(shù)來治療β地中海貧血取得重大進(jìn)展，通過對自身iP?Sc進(jìn)行修復(fù)，并最終使細(xì)胞能夠表達(dá)相應(yīng)的HBB蛋白［9-13］。但筆者同時也要看到iPS疾病模型的不足，如建成細(xì)胞所需要的時間成本及所用的轉(zhuǎn)導(dǎo)方式介質(zhì)對其后續(xù)的治療影響均需要考慮。

圖8 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞核型Fig.8 Karyotypes of iPS

仙臺病毒為非整合方法，對于基因組來說是一種產(chǎn)生iPSC的安全方法，且相對其他誘導(dǎo)方法更為高效［14-15］。筆者通過使用仙臺病毒從Hb Bart′s的胎兒的人羊水細(xì)胞中建成了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，并對建立的干細(xì)胞進(jìn)行了相關(guān)多能性檢測。堿性磷酸酶（AP）活性通常在胚胎干細(xì)胞等全能或多能干細(xì)胞表現(xiàn)較高，當(dāng)胚胎細(xì)胞發(fā)生分化后，AP活性隨之降低，而筆者的細(xì)胞堿性磷酸酶染色結(jié)果呈陽性。另外，免疫熒光檢測也是干細(xì)胞多能性常用的典型檢測方法，如干細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物如SSEA4，TRA?1?81，SOX2和OCT4等，所建立的iPS均為陽性。同時對誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的多能性標(biāo)志基因SOX2、NANOG、LIN28和OCT4表達(dá)進(jìn)行RT?PCR檢測亦提示為陽性。筆者還對細(xì)胞進(jìn)行體外和體內(nèi)分化能力進(jìn)行了評估，通過自發(fā)分化EB和畸胎瘤形成實(shí)驗，均形成外胚層、中胚層和內(nèi)胚層3個胚層，提示其分化的全能性。為了驗證所產(chǎn)生的細(xì)胞是否有變異，本研究對細(xì)胞進(jìn)行了核型分析，結(jié)果顯示仍維持正常的二倍體核型。從筆者的實(shí)驗結(jié)果可以看到，均提示筆者成功建立了Bart′s水腫胎兒綜合征誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

α-地貧在我國南方地區(qū)為最常見的遺代傳病之一，特別是Hb Bart′s為致死性疾病，目前尚無根治方法，而只有通過產(chǎn)前診斷來進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)，一旦發(fā)現(xiàn)即選擇終止妊娠處理，若要治療這種疾病可能需要進(jìn)行宮內(nèi)治療。隨著基因治療方法策略的發(fā)展［10，16-17］，結(jié)合誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)，可以用其來研究對應(yīng)疾病的病理機(jī)制，同時可為個體化治療方案提供基礎(chǔ)，利用修復(fù)遺傳病突變基因，獲得胎兒正常的iPS細(xì)胞，有望利用iPS技術(shù)對胎兒進(jìn)行宮內(nèi)治療以減少出生缺陷所帶來的巨大經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。有了Hb Bart′s水腫胎兒綜合征細(xì)胞模型，將為筆者下一步探討該疾病研究及治療工作提供重要工具，可以先在細(xì)胞層面上進(jìn)行探究以減少直接對病人試驗所帶來的傷害。

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