芥藍(lán)BC3代Ogura CMS育性恢復(fù)材料的創(chuàng)制及Rfo基因傳遞和背景分析

于海龍，李志遠(yuǎn)，楊麗梅，劉玉梅，莊木，呂紅豪，李占省，方智遠(yuǎn)，張揚(yáng)勇

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芥藍(lán)BC3代Ogura CMS育性恢復(fù)材料的創(chuàng)制及基因傳遞和背景分析

于海龍1,2，李志遠(yuǎn)2，楊麗梅2，劉玉梅2，莊木2，呂紅豪2，李占省2，方智遠(yuǎn)1,2，張揚(yáng)勇2

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

【目的】創(chuàng)制Ogura細(xì)胞質(zhì)不育（Ogura CMS）的恢復(fù)系是利用Ogura CMS種質(zhì)資源的有效途徑。本研究基于已獲得的BC2代育性恢復(fù)單株15Q23，繼續(xù)用芥藍(lán)進(jìn)行回交，通過(guò)分析育性恢復(fù)基因的傳遞效率，及BC3代陽(yáng)性株的遺傳背景、育性表現(xiàn)、結(jié)實(shí)性和倍性，從而加速甘藍(lán)類蔬菜Ogura CMS恢復(fù)材料的創(chuàng)制，獲得甘藍(lán)類蔬菜Ogura CMS恢復(fù)系。【方法】以BC2代育性較好的單株15Q23為父本，Ogura CMS芥藍(lán)15Y102為母本進(jìn)一步回交，利用特異分子標(biāo)記對(duì)所有回交后代進(jìn)行篩選，計(jì)算BC3代傳遞效率，并調(diào)查BC3代陽(yáng)性單株的形態(tài)特征、育性恢復(fù)情況、結(jié)實(shí)性、倍性；選取遺傳背景近于芥藍(lán)、結(jié)實(shí)較好的重點(diǎn)單株繼續(xù)回交獲得BC4代，分析BC4代傳遞效率和陽(yáng)性單株倍性。【結(jié)果】在開(kāi)花的不同時(shí)期，單株15Q23花粉活力差異明顯，以不同時(shí)期的花粉進(jìn)行回交的結(jié)實(shí)性也存在極顯著差異（＜0.01），平均結(jié)實(shí)率為0.07粒/授粉花蕾（7%）。利用特異標(biāo)記對(duì)獲得的BC3代單株進(jìn)行苗期篩選，結(jié)果表明，可穩(wěn)定傳遞，遺傳背景分析結(jié)果表明，BC3代單株與芥藍(lán)15Y102遺傳相似系數(shù)在0.81—0.92，遺傳背景比BC2代單株15Q23（0.73）更近于芥藍(lán)，形態(tài)標(biāo)記聚類結(jié)果與遺傳背景標(biāo)記聚類結(jié)果一致。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，BC3單株形態(tài)特征都近于芥藍(lán)，但生長(zhǎng)勢(shì)較親本芥藍(lán)更強(qiáng)；倍性鑒定結(jié)果表明，多數(shù)BC3后代接近于四倍體。開(kāi)花后觀察34個(gè)BC3后代單株的育性，有標(biāo)記的單株育性均得到恢復(fù)。但不同單株間花粉活力存在差異，單株16Q1-4、16Q1-7、16Q1-10在整個(gè)花期花粉活力一直在75%以上。利用親本芥藍(lán)對(duì)花粉活力較好的陽(yáng)性單株（花粉活力＞50%）進(jìn)行回交，以單株16Q1-4和單株16Q1-10當(dāng)父本時(shí)結(jié)實(shí)性最好，結(jié)實(shí)率分別為15%和9%，顯著高于BC2代陽(yáng)性單株15Q23（7%，＜0.05）。BC4代單株中可以穩(wěn)定傳遞，傳遞效率接近33%；對(duì)以16Q1-4為父本回交獲得的24株陽(yáng)性株進(jìn)行倍性檢測(cè)，不同單株間倍性差異較大，其中3株的熒光峰值和親本芥藍(lán)相近，倍性近于芥藍(lán)。【結(jié)論】利用芥藍(lán)對(duì)種間雜交六倍體陽(yáng)性株進(jìn)行第3、第4代回交，可穩(wěn)定傳遞，成功獲得了遺傳背景、形態(tài)特征近于親本芥藍(lán)，結(jié)實(shí)性較BC2代單株15Q23顯著提升的BC3代Ogura CMS育性恢復(fù)材料16Q1-4和16Q1-10。

芥藍(lán)；育性恢復(fù)；傳遞效率；遺傳背景

0 引言

【研究意義】針對(duì)甘藍(lán)類蔬菜（）中缺乏Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Ogura cytoplasmic male sterility，Ogura CMS）育性恢復(fù)材料的問(wèn)題，利用遠(yuǎn)緣雜交結(jié)合胚挽救將育性恢復(fù)基因（restorer- of-fertility gene）從甘藍(lán)型油菜導(dǎo)入芥藍(lán)中[1]。對(duì)加倍后的種間雜種進(jìn)行回交，已分別獲得BC1和BC2代育性恢復(fù)材料[2]。但這些材料遺傳背景還與芥藍(lán)有較大差異，仍需進(jìn)一步回交，保留的同時(shí)盡可能消除甘藍(lán)型油菜的遺傳背景，這對(duì)最終實(shí)現(xiàn)Ogura CMS甘藍(lán)類蔬菜的育性恢復(fù)、打破國(guó)外公司利用Ogura CMS對(duì)特異種質(zhì)的壟斷具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】甘藍(lán)類蔬菜是蕓薹屬中典型的異花授粉植物，雜種優(yōu)勢(shì)十分明顯，利用雄性不育系進(jìn)行雜交種生產(chǎn)是甘藍(lán)類蔬菜雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑之一[3]。Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育系由于其不育性穩(wěn)定，轉(zhuǎn)育容易，已成為甘藍(lán)類蔬菜可實(shí)用的主要不育源[4]。早在20世紀(jì)70年代，Bannerot等[5]利用遠(yuǎn)緣雜交將蘿卜中的Ogura胞質(zhì)不育轉(zhuǎn)到甘藍(lán)類蔬菜中，并經(jīng)過(guò)原生質(zhì)體融合將其改良后[6]，Ogura CMS已逐漸成為甘藍(lán)類蔬菜雜交制種中廣泛應(yīng)用的細(xì)胞質(zhì)不育類型[7]。但隨著Ogura CMS的推廣利用，近幾年來(lái)越來(lái)越多的優(yōu)異品種是胞質(zhì)不育育成，不能自交分離，無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行材料的創(chuàng)新利用[8-10]。而創(chuàng)制Ogura CMS的恢復(fù)系是解決這一問(wèn)題的有效途徑，但在甘藍(lán)中不存在天然的Ogura CMS恢復(fù)材料。甘藍(lán)型油菜Ogura CMS恢復(fù)系的研究歷經(jīng)30余年[11-12]，已將從蘿卜屬中導(dǎo)入到甘藍(lán)型油菜，并整合到了甘藍(lán)型油菜的C09染色體上[13-14]，成功創(chuàng)制出恢復(fù)系并應(yīng)用于甘藍(lán)型油菜Ogura CMS制種，Ogu-CMS/育種體系開(kāi)始成為甘藍(lán)型油菜雜交種生產(chǎn)的主要技術(shù)之一，這為研究者將甘藍(lán)型油菜中向甘藍(lán)類蔬菜轉(zhuǎn)移提供了可能。為縮短轉(zhuǎn)育年限，Yu等[1-2]選擇甘藍(lán)類蔬菜中容易春化、繁殖周期短的變種芥藍(lán)作為轉(zhuǎn)育材料，利用遠(yuǎn)緣雜交結(jié)合胚挽救技術(shù)，將導(dǎo)入Ogura CMS芥藍(lán)中，并對(duì)加倍的F1代（種間六倍體雜種）多代回交，結(jié)合形態(tài)、育性、遺傳背景分析，篩選獲得育性恢復(fù)、結(jié)實(shí)性好的BC2代陽(yáng)性單株。【本研究切入點(diǎn)】選育的BC2代陽(yáng)性單株（15Q23）的遺傳背景與芥藍(lán)仍有不少差異，需要進(jìn)一步回交以減少背景的干擾；且15Q23自然結(jié)實(shí)性仍很低（＜0.1粒/種莢），遠(yuǎn)達(dá)不到正常水平，自然授粉結(jié)實(shí)性有待進(jìn)一步提升。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用芥藍(lán)對(duì)BC2代育性較好的單株15Q23進(jìn)一步回交，分析BC3代和BC4代的傳遞效率（transmission rate，TR），分析BC3代單株遺傳背景，獲得育性恢復(fù)、花粉活力好、結(jié)實(shí)性強(qiáng)的BC3代單株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

回交母本：Ogura CMS芥藍(lán)15Y102。第3代回交父本：芥藍(lán)與甘藍(lán)型油菜雜交后的BC2代中育性較好的單株15Q23，這是前期試驗(yàn)中利用芥藍(lán)和含的甘藍(lán)型油菜進(jìn)行種間雜交，獲得的種間雜種加倍后，回交兩代后利用特異分子標(biāo)記篩選結(jié)合形態(tài)、遺傳背景分析獲得的，該單株育性恢復(fù)、花粉活力顯著優(yōu)于其余單株，形態(tài)更接近于親本芥藍(lán)且結(jié)實(shí)性良好[1-2]。第4代回交父本：第3代回交后用標(biāo)記篩選獲得的育性恢復(fù)、背景更接近芥藍(lán)母本的優(yōu)良單株。

上述材料均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所甘藍(lán)課題組提供，于2015年、2016年秋季定植于本所南圃場(chǎng)，常規(guī)栽培管理。

1.2 BC3代單株的獲得及Rfo陽(yáng)性單株的篩選

2016年3月，在盛花期進(jìn)行人工剝蕾去雄授粉，并掛牌標(biāo)記雜交組合、授粉花蕾數(shù)，計(jì)算結(jié)實(shí)率（seed setting）等，結(jié)實(shí)率=飽滿種子數(shù)/授粉花蕾數(shù)×100%。

將收獲的BC3代種子分兩批播種，第一批挑選少量種子于2016年7月底播種（編號(hào)為16Q），用于初篩，調(diào)查陽(yáng)性株比例、形態(tài)特征和分析遺傳背景；第二批在10月初播種，篩選陽(yáng)性單株用于大規(guī)模的回交轉(zhuǎn)育（編號(hào)為16QW）。所有BC3單株成苗后，采用改良CTAB法提取基因組DNA[15]。利用已開(kāi)發(fā)的特異標(biāo)記[1]（-2F/-NEW-R）對(duì)兩批BC3群體進(jìn)行篩選，PCR擴(kuò)增方法、體系及檢測(cè)方法參照Yu等[1]，計(jì)算的傳遞效率，傳遞效率=陽(yáng)性單株數(shù)目/群體總單株數(shù)×100%。

1.3 16Q群體形態(tài)學(xué)性狀調(diào)查及遺傳背景分析

將16Q群體于9月初定植于溫室，對(duì)各單株成熟期的形態(tài)特征進(jìn)行觀察和調(diào)查。共對(duì)16個(gè)形態(tài)特征進(jìn)行調(diào)查，其中10個(gè)性狀采取分級(jí)賦值法（表1），包括株型、基生葉顏色、基生葉形狀、基生葉葉緣、基生葉葉面、葉面蠟粉、葉面光澤、基生葉翼、基生葉葉脈、花瓣顏色。另外6個(gè)性狀利用刻度尺進(jìn)行測(cè)量，包括株高、基生葉長(zhǎng)、基生葉寬、葉柄長(zhǎng)、花直徑、花蕾長(zhǎng)，這些測(cè)量數(shù)據(jù)根據(jù)王述民等[16]方法進(jìn)行10級(jí)分類轉(zhuǎn)化，1級(jí)＜M-2σ，10級(jí)≥M＋2σ，M代表平均值，σ為標(biāo)準(zhǔn)差，每一級(jí)差0.5σ。對(duì)統(tǒng)計(jì)的性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，利用NTSYSpc2.11a軟件，采用非加權(quán)類平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。

利用于海龍等[17]開(kāi)發(fā)的芥藍(lán)與甘藍(lán)型油菜之間的32對(duì)SSR多態(tài)性背景標(biāo)記，對(duì)16Q群體的遺傳背景進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)體系及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法均參照于海龍等[17]。針對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)生的每個(gè)等位變異，不同材料在該等位變異處有帶記為1，無(wú)帶記為0。利用NTSYSpc2.11a軟件計(jì)算親本和各世代單株間的遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA進(jìn)行聚類分析。

1.4 BC3代Rfo陽(yáng)性單株花粉活力評(píng)估和倍性分析

于盛花期對(duì)16Q群體中篩選的陽(yáng)性單株的育性進(jìn)行觀察，并測(cè)定花粉活力。花粉活力測(cè)定采用醋酸洋紅染色法，取植株新開(kāi)的3朵花，將其花粉均勻涂于載玻片上，用1%的醋酸洋紅染色，觀察3個(gè)視野（視野內(nèi)花粉粒數(shù)≥300）。為方便數(shù)據(jù)處理，對(duì)花粉活力進(jìn)行分級(jí)，共劃分4個(gè)等級(jí)，1級(jí)：≤25%；2級(jí)：25%＜花粉活力≤50%；3級(jí)：50%＜花粉活力＜75%；4級(jí)：花粉活力≥75%。

利用流式細(xì)胞儀對(duì)16Q群體中的陽(yáng)性單株采用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）方法進(jìn)行倍性鑒定。參照Dolezel等[18]關(guān)于植物DNA相對(duì)含量測(cè)定的方法，略有改動(dòng)，具體方法如下：取待測(cè)樣品葉片200 mg，分別加入1—1.5 ml細(xì)胞裂解液（Galbraith’s buffer），以一次性鋒利刀片切碎組織，混合勻漿，利用400目濾網(wǎng)將勻漿過(guò)濾到1.5 mL離心管中，濾液體積應(yīng)＞500 μL，棄上清，加入PI染液（工作濃度50 μg·mL-1）對(duì)核進(jìn)行染色，避光處理30 min后，上機(jī)（BD FACSCaliburTM，BD Biosciences，San Jose，CA，USA）測(cè)量。以芥藍(lán)2C DNA相對(duì)含量為參照，將其G0/G1期對(duì)應(yīng)峰值調(diào)整到200通道處，根據(jù)雜種后代G0/G1期峰值的位置，判斷其倍性。

表1 芥藍(lán)和甘藍(lán)型油菜雜交后回交后代的性狀調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.5 BC4回交后代的獲得、Rfo陽(yáng)性單株的篩選及倍性分析

結(jié)合背景分析和育性調(diào)查結(jié)果，挑選16Q群體中育性較好、背景近于芥藍(lán)的陽(yáng)性單株為重點(diǎn)，與芥藍(lán)15Y102進(jìn)行第4代回交，統(tǒng)計(jì)每單株授粉花蕾數(shù)及結(jié)籽情況，計(jì)算各陽(yáng)性單株的結(jié)實(shí)率。將獲得的部分BC4代種子于2017年1月初播種，成苗后利用特異標(biāo)記篩選陽(yáng)性株，計(jì)算傳遞效率。

選取部分BC4代陽(yáng)性單株利用流式細(xì)胞儀對(duì)其倍性進(jìn)行鑒定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和計(jì)算利用Microsoft Office Excel 2003，不同組合間方差分析、相關(guān)性分析和顯著性檢驗(yàn)均使用SPSS 11.0軟件（SPSS，Chicago，IL，USA）。

2 結(jié)果

2.1 BC3代單株的獲得及Rfo陽(yáng)性單株的篩選

以15Q23為父本，利用Ogura CMS芥藍(lán)15Y102為母本進(jìn)行回交。在整個(gè)花期對(duì)15Q23的育性觀察發(fā)現(xiàn)，15Q23在整個(gè)花期的不同階段，該單株育性的差異較大，整體表現(xiàn)為開(kāi)花后20 d內(nèi)15Q23育性較好，花粉活力較高，平均花粉活力87%（表2、圖1-a）；20 d后，該單株花粉活力43%，部分花朵的花藥上甚至觀察不到花粉（表2、圖1-b）。兩個(gè)時(shí)期結(jié)實(shí)率存在極顯著差異（＜0.01），開(kāi)花20 d內(nèi)共收獲種子265粒，結(jié)實(shí)率為13%，而開(kāi)花20 d后，這段時(shí)期僅收獲種子40粒（表2）。相關(guān)性分析表明，結(jié)實(shí)率和花粉活力間存在極顯著正相關(guān)（＜0.01）。

將收獲的305粒種子分兩批播種，第一批播種43粒，成苗34株（即16Q群體），利用特異標(biāo)記篩選，17株為陽(yáng)性（圖1-c），傳遞效率為50%；第二批播種262粒，成苗229株（即16QW群體），特異標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果表明，109株為陽(yáng)性，傳遞效率為48%。兩個(gè)群體陽(yáng)性株與不含單株比值都近于1﹕1。

表2 15Q23單株在開(kāi)花前期及后期的結(jié)實(shí)性比較

**代表在= 0.01水平上存在極顯著差異

** represents extremely significant difference at=0.01 level

圖c中1、2：芥藍(lán)Chinese kale；3、4：Rfo甘藍(lán)型油菜rapeseed with Rfo；5：15Q23；6—16：16Q群體部分單株（6、10、12、13、14、16為Rfo陽(yáng)性株）Some individuals of 16Q group (6, 10, 12, 13, 14, 16 are Rfo-positive individuals)

2.2 BC3后代的遺傳背景、形態(tài)和倍性分析

利用背景標(biāo)記分析16Q群體的34株成苗后代的遺傳背景，并觀察其形態(tài)特征，期望獲得形態(tài)學(xué)特征和遺傳背景近于親本芥藍(lán)的單株。

將16Q群體的34株單株于2016年9月初定植于溫室，對(duì)各單株的形態(tài)進(jìn)行觀察比較。34株BC3單株的形態(tài)整體上都近于芥藍(lán)，如株型（半直立），葉型（卵圓、橢圓），葉面（微皺），葉色（深綠），葉面蠟粉（中），花瓣顏色（白）等性狀基本與芥藍(lán)一致（圖2）。較親本芥藍(lán)，BC3代陽(yáng)性單株的生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，最大外葉長(zhǎng)、最大外葉寬、莖粗、株高、花朵直徑等性狀的值均略高于親本芥藍(lán)。

苗期Seedling stage（a：15Y102；d：16Q1-4）、成熟期Mature stage（b：15Y102；e：16Q1-4）、開(kāi)花期flowering stage（c：15Y102；f：16Q1-4）

對(duì)34株BC3代單株進(jìn)行遺傳背景聚類，結(jié)果表明在遺傳相似系數(shù)0.74處，34株BC3后代和芥藍(lán)15Y102聚為一類，與芥藍(lán)15Y102遺傳相似系數(shù)在0.81—0.92，高于其回交用父本15Q23（0.73）。其中，單株16Q1-34與芥藍(lán)間遺傳相似系數(shù)最高，為0.92，17個(gè)陽(yáng)性株中，單株16Q1-8、16Q1-13、16Q1-18與親本芥藍(lán)間的遺傳相似系數(shù)為0.90（圖3-a）。

利用形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)BC3后代植株的表型進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明34株BC3后代與芥藍(lán)15Y102聚為一個(gè)分支，甘藍(lán)型油菜單獨(dú)聚成一個(gè)分支，背景標(biāo)記和形態(tài)學(xué)標(biāo)記都表明所有BC3后代遺傳背景近于親本芥藍(lán)。與背景標(biāo)記聚類結(jié)果相比，利用形態(tài)數(shù)據(jù)聚類時(shí)，16Q群體中部分單株無(wú)法區(qū)分，表明形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)聚類分辨率較低（圖3-b）。

利用流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)34株BC3后代（16Q）的倍性進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖4所示，34株BC3后代單株倍性仍為多倍體形式。以芥藍(lán)為參照標(biāo)準(zhǔn)（200），34個(gè)BC3后代中，只有單株16Q1-13的熒光峰值位于300通道處，推測(cè)倍性接近于三倍體；其余33個(gè)單株（包括陽(yáng)性單株和不含的單株）的熒光峰值都位于400通道處，推測(cè)倍性接近于四倍體。

2.3 BC3代Rfo陽(yáng)性單株的育性調(diào)查

開(kāi)花后對(duì)所有單株育性進(jìn)行調(diào)查，34個(gè)單株育性表現(xiàn)與標(biāo)記篩選結(jié)果完全一致，所有陽(yáng)性單株均有不同程度的花粉出現(xiàn)（圖2-f），其余單株均為不育，標(biāo)記篩選準(zhǔn)確率達(dá)到100%。不同單株間育性表現(xiàn)存在差異，對(duì)陽(yáng)性單株的花粉活力進(jìn)行測(cè)定，單株16Q1-4、16Q1-7、16Q1-10在整個(gè)花期育性較好，花粉活力一直在75%以上（表3）。利用芥藍(lán)對(duì)育性較好的陽(yáng)性單株（16Q1-4、16Q1-7、16Q1-8、16Q1-10、16Q1-13、16Q1-19、16Q1-25、16Q1-27、16Q1-35，花粉活力＞2級(jí)）進(jìn)行回交，結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明（表3），單株16Q1-4和單株16Q-10結(jié)實(shí)性最好，結(jié)實(shí)率分別為15%和9%。顯著性分析結(jié)果表明，較回交用父本BC2代陽(yáng)性單株15Q23，單株16Q1-4和單株16Q-10結(jié)實(shí)率顯著提高（＜0.05）。相關(guān)性分析表明，BC3代陽(yáng)性單株的結(jié)實(shí)率與花粉活力顯著正相關(guān)（＜0.05，=0.697*）。

圖3 SSR背景標(biāo)記（a）和形態(tài)標(biāo)記（b）用于34株BC3后代的聚類分析

圖4 BC2后代15Q23及BC3后代16Q1-4和16Q1-13的倍性鑒定

表3 BC3代花粉活力＞2級(jí)的單株的遺傳相似系數(shù)、結(jié)實(shí)率及其回交后代Rfo傳遞效率

2.4 BC4代的獲得及Rfo傳遞效率

收獲16Q群體中陽(yáng)性單株16Q1-4、16Q1-7、16Q1-8、16Q1-10、16Q1-35回交獲得的種子，播種成苗后利用特異標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明（表3、圖5-a），不同單株回交后獲得的BC4代中均含有陽(yáng)性株，5株BC3代陽(yáng)性株中除16Q1-35外（TR=45%），其余4株的傳遞效率均接近33%。該結(jié)果表明在BC4代可以穩(wěn)定傳遞，但傳遞效率仍不正常，這可能是由于BC3代陽(yáng)性單株的染色體組成仍為多倍體所導(dǎo)致。

對(duì)16Q1-4的24株陽(yáng)性株進(jìn)行倍性檢測(cè)（圖5），不同單株間倍性差異較大，3株位于180—200（圖5-b），14株陽(yáng)性株峰值位于200—300（圖5-c），7株位于300—400（圖5-d）。上述結(jié)果表明，利用芥藍(lán)對(duì)種間六倍體陽(yáng)性株多代回交，其倍性存在分離，可從中獲得倍性近于親本芥藍(lán)的材料，但其遺傳組成仍需進(jìn)一步分析。

a：16Q1-4的70個(gè)回交后代Rfo篩選Rfo screening of 70 backcross progenies of 16Q1-4。1：芥藍(lán)Chinese kale 15Y102；2：15Q23；3—72：16Q1-4的回交后代70 backcross progenies of 16Q1-4。b：?jiǎn)沃甑臒晒夥逯滴挥?00 the peaks of G0/G1 peak on 200 channels；c：?jiǎn)沃甑臒晒夥逯滴挥?90 the peaks of G0/G1 peak on 290 channels；d：?jiǎn)沃甑臒晒夥逯滴挥?90 The peaks of G0/G1 peak on 390 channels

3 討論

3.1 蕓薹屬遠(yuǎn)緣雜交中種間三倍體的利用

甘藍(lán)型油菜（AACC）是由甘藍(lán)（CC）和白菜（AA）雜交后自然加倍獲得的，三者同屬十字花科蕓薹屬，親緣關(guān)系較近[19]（U，1935）。遠(yuǎn)緣雜交已成為三者間遺傳背景拓展和種質(zhì)資源改良的重要手段，但往往表現(xiàn)出雜交親和障礙，雜種后代育性較差等問(wèn)題，需要進(jìn)行多輪胚挽救，多代回交和大量授粉工作才能克服[20-24]。白菜（AA）與甘藍(lán)型油菜（AACC）間親和性較強(qiáng)，較易獲得F1種間雜種AAC，利用兩者間遠(yuǎn)緣雜交后多代自交是甘藍(lán)型油菜遺傳背景拓展的重要手段之一[25-26]，且前人研究表明F1后代AAC育性較高，花粉活力＞50%，且在減數(shù)分裂時(shí)期，A染色體間配對(duì)穩(wěn)定，整倍體配子出現(xiàn)頻率較高（5%—15%，A/AC，n=10/19）[27-28]。不同于白菜AA和甘藍(lán)型油菜AACC遠(yuǎn)緣雜交較易獲得后代，甘藍(lán)類蔬菜CC和甘藍(lán)型油菜之間進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交很難獲得后代，前人相關(guān)研究較少，且很少進(jìn)行多代回交轉(zhuǎn)育[20-21,29]。此外，CC×AACC雜交后獲得的種間雜種ACC單株育性較差，很難進(jìn)行回交得到后代，張玉成等[30]利用結(jié)球甘藍(lán)做父本與ACC單株進(jìn)行雜交，結(jié)莢正常，但后代結(jié)實(shí)率僅為0.01%；Yang等[31]對(duì)ACC單株的育性和減數(shù)分裂行為進(jìn)行調(diào)查，試驗(yàn)結(jié)果表明，ACC單株減數(shù)分裂時(shí)期染色體分離異常，且在A和C染色體組之間常出現(xiàn)異源聯(lián)會(huì)，植株不育，無(wú)法獲得后代；Li等[32]觀察到ACC的花粉母細(xì)胞終變期配對(duì)形式多為9Ⅱ＋10Ⅰ或10Ⅱ＋8Ⅰ形式，在減數(shù)分裂后期多為不均等分離，配子以13﹕15和14﹕14的分離形式比例最高，有觀察到出現(xiàn)9﹕19的分離形式，這表明ACC單株在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期可能會(huì)出現(xiàn)整倍體配子（C/AC）。在前期研究中，利用芥藍(lán)對(duì)獲得的種間F1三倍體育性恢復(fù)單株YL2進(jìn)行了回交[1]，獲得了形態(tài)特征近于母本芥藍(lán)的后代，但經(jīng)特異標(biāo)記檢測(cè)，沒(méi)有陽(yáng)性株，全為不育類型。目前沒(méi)有研究報(bào)道ACC可以與CC回交獲得CC型后代。今后，在甘藍(lán)與甘藍(lán)型油菜的遠(yuǎn)緣雜交試驗(yàn)中，可嘗試對(duì)種間雜種F1（ACC）進(jìn)行大量正反交，期望直接分離出整倍體C型配子，從而縮短異源基因的轉(zhuǎn)育年限。

3.2 六倍體AACCCC在Rfo基因轉(zhuǎn)育中的影響

前人研究表明，對(duì)CC和AACC獲得的ACC雜種進(jìn)行染色體加倍，獲得AACCCC單株，可有效提高與AA或AACC基因型材料雜交的結(jié)實(shí)性[33-34]。AACCCC多數(shù)花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂時(shí)期多是28﹕28（18C+10A﹕18C+10A）分離，分離規(guī)律相對(duì)穩(wěn)定[34]，錢偉等[35]發(fā)明了以甘藍(lán)型油菜與甘藍(lán)雜交，染色體加倍獲得的六倍體為橋梁再與白菜雜交，創(chuàng)建新型甘藍(lán)型油菜的方法。利用該橋梁，將野生甘藍(lán)中的菌核病抗性分別轉(zhuǎn)移到白菜型油菜和甘藍(lán)型油菜中，且后代結(jié)實(shí)正常[33-34]；不同于AACCCC與CC或AACC雜交，AACCCC與CC雜交很難正常結(jié)實(shí)，且回交兩代后染色體仍分離異常[2]，在前期研究中，為保證傳遞，提高種間雜種單株育性，筆者將獲得F1代種間陽(yáng)性株進(jìn)行加倍處理，并利用芥藍(lán)對(duì)加倍后AACCCC單株進(jìn)行第二代回交，20 733個(gè)種莢中僅獲得98個(gè)單株，其中5株為陽(yáng)性，結(jié)合形態(tài)、背景和育性比較，篩選出1株遺傳背景、形態(tài)特征近于芥藍(lán)、育性恢復(fù)穩(wěn)定、可不進(jìn)行胚挽救自然少量結(jié)實(shí)（結(jié)實(shí)率=7%）的BC2代單株15Q23[2]。本研究以該單株15Q23為父本，利用芥藍(lán)對(duì)其進(jìn)一步回交后獲得126株陽(yáng)性單株，可穩(wěn)定傳遞（表2，TR=48%），BC3后代遺傳背景較上一代單株15Q23更近于芥藍(lán)，部分單株育性穩(wěn)定，花粉活力＞75%（表3，16Q1-4、16Q1-7、16Q1-10），單株16Q1-4和16Q1-10結(jié)實(shí)性較15Q23有顯著提高（＜0.05）。后期倍性鑒定結(jié)果表明，15Q23為BC1代單株（AnCnCoCo）與芥藍(lán)回交后獲得，倍性近于四倍體（圖4），是對(duì)照芥藍(lán)的2倍，DNA相對(duì)含量高于甘藍(lán)型油菜（AnCnAnCn）。根據(jù)倍性推測(cè)，15Q23組成形式可能為CoCoCnC*A*（C*和A*表示非整套染色體組），其中一套完整的Co來(lái)源于回交芥藍(lán)，其余染色體是由于BC1代AnCnCoCo染色體配對(duì)異常，導(dǎo)致染色體不均等分離，BC1單株形成了CoCnC*A*型的配子，根據(jù)染色體組成形式和15Q23后代陽(yáng)性株比例，推測(cè)位點(diǎn)的基因型可能為，分別位于4套C染色體組上。而15Q23回交后產(chǎn)生的BC3代陽(yáng)性單株的倍性介于三倍體和四倍體之間，傳遞效率均接近33%（表3、圖4），推測(cè)染色體組成形式可能為CoCoC*A*，位點(diǎn)的基因型可能為，分別位于3套C染色體組上。因此，對(duì)ACC進(jìn)行染色體加倍有利于提高雜種后代的育性以及保證的穩(wěn)定傳遞，但BC3后代的染色體倍性還比較混雜，雜種后代的染色體要完全恢復(fù)到親本芥藍(lán)的水平仍需多代回交和大量授粉。然而，當(dāng)利用BC3代育性較好的單株進(jìn)一步回交獲得BC4后代時(shí)，發(fā)現(xiàn)不僅可以繼續(xù)穩(wěn)定傳遞（表3），而且還有部分單株的倍性非常接近于親本芥藍(lán)（圖5）。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，設(shè)想可結(jié)合小孢子培養(yǎng)和遺傳組成分析，期望在多倍體陽(yáng)性后代中分離出正常的CC配子；或?qū)﹄s種后代中倍性近于二倍體的后代進(jìn)行自交和正反交，加快甘藍(lán)類蔬菜（2C=18）Ogura CMS恢復(fù)材料的獲得。

4 結(jié)論

利用芥藍(lán)對(duì)芥藍(lán)-甘藍(lán)型油菜BC2代育性較好單株15Q23進(jìn)一步回交，獲得了BC3和BC4后代。特異標(biāo)記篩選結(jié)果表明，在兩個(gè)世代可穩(wěn)定傳遞。倍性鑒定結(jié)果表明，BC4代倍性存在分離，部分陽(yáng)性單株倍性接近于親本芥藍(lán)。結(jié)合背景分析、形態(tài)觀察、育性比較，獲得了兩株育性穩(wěn)定、形態(tài)特征近于芥藍(lán)、遺傳背景和結(jié)實(shí)性較上一代顯著提升的BC3單株16Q1-4和16Q1-10。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Development of fertility-restored BC3progenies in Ogura CMS Chinese kale and analysis on Gene transmission rate ofand genetic background

YU HaiLong1,2, LI ZhiYuan2, YANG LiMei2, LIU YuMei2, ZHUANG Mu2, Lü HongHao2, LI ZhanSheng2, FANG ZhiYuan1,2, ZHANG YangYong2

(1College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi;2Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

【Objective】Development of Ogura cytoplasmic male sterility (Ogura CMS) restorer lines is an effective way to utilize Ogura CMS germplasm resources. In order to obtain the Ogura CMS fertility-restored lines in, BC2fertility-restored individuals 15Q23 were backcrossed with Chinese kale parent, and the transmission rate (TR) ofrestorer gene, genetic background, seed setting and ploidy were investigated in the BC3-positive progenies, which will accelerate the creation the Ogura CMS fertility restorer lines in. 【Method】The BC2fertility-restored individual 15Q23 with better fertility performance was chosen as male parent to backcross with Ogura CMS Chinese kale 15Y102. The BC3progenies were produced and screened by thespecific markers. The TR ofin BC3generations was calculated. Morphological identification, fertility observation, seed setting ability and ploidy evaluation were performed to select BC3-positive individuals with better seed setting and genetic background similar to the parent Chinese kale; these individuals were then used as pollen donors to develop the BC4generation. The TR ofand ploidy of the-positive individuals in BC4generations were evaluated. 【Result】The pollen viability and seed setting of 15Q23 differed at different flowering periods, with an average of 0.07 seeds per pod (7%). The BC3generations individuals were screened by-specific marker and thecould be transmitted stably. The genetic similarity coefficients between BC3individuals and Chinese kale 15Y102 were 0.81-0.92, higher than that of 15Q23 (0.73), indicating that the genetic background of BC3individuals was closer to the parent Chinese kale. These results were further confirmed by the clustering result of morphological markers. Morphological observation revealed that the BC3individuals were very similar to the parent Chinese kale 15Y102, whereas the growth vigor of BC3individual was higher than that of the parent Chinese kale. Ploidy identification showed that most of the BC3individuals were still close to tetraploid. During the flowering stage, all of the BC3-positive individuals were fertility-restored and the pollen viability of them was different among different BC3individuals. The individuals 16Q1-4, 16Q1-7, 16Q1-10 showed better fertility performance during the whole flowering period, and their pollen viability was above 75%. The individuals with ＞50% pollen viability were chosen as pollen donors to backcross with Chinese kale and their seed setting was calculated. Compared with other BC3-positive individuals, the seed setting of individual 16Q1-4 and 16Q1-10 was 15% and 9%, respectively, much higher than other BC3-positive individuals, and significantly higher than that of 15Q23 (7%,＜0.05). Furthermore, thecould be transmitted in BC4generation and the TR ofwas nearly 33%. Ploidy identification was performed among the 24 BC4-positive individuals, which were derived from 16Q1-4. The results indicated that the ploidy differed in the 24 BC4-positive individuals and the peaks of G0/G1period in three individuals were close to that of parent Chinese kale. 【Conclusion】The interspecific hexaploid hybrid was further backcrossed with Chinese kale to produce the BC3and BC4generations. The results indicated that thecan be stably transmitted. Two individuals, 16Q1-4 and 16Q1-10, morphologically similar to parent Chinese kale 15Y102, have been successfully created with closer genetic background to Chinese kale compared with BC2pollen donor 15Q23, and significantly improved seed setting.

Chinese kale; fertility restoration; transmission rate (TR) of; genetic background

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.012

2018-01-11；

2018-03-06

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0101702）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31572141）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-25）、農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目

于海龍，E-mail：yuhailongnet@163.com。李志遠(yuǎn)，E-mail：lizy1992@126.com。于海龍和李志遠(yuǎn)為同等貢獻(xiàn)作者。

方智遠(yuǎn)，E-mail：cabbage8756@126.com。通信作者張揚(yáng)勇，E-mail：zhangyangyong@caas.cn