菊花AINTEGUMENTA克隆與功能分析

溫立柱，孫霞，樊紅梅，郭蕓琿，于媛媛，任紅，王文莉，鄭成淑

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菊花克隆與功能分析

溫立柱，孫霞，樊紅梅，郭蕓琿，于媛媛，任紅，王文莉，鄭成淑

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/山東省中日韓菊花國際合作研究中心，山東泰安 271018）

【目的】從菊花中分離克隆，分析其序列特征和在菊花中的時(shí)空表達(dá)特性，通過基因沉默研究其對菊花花序發(fā)育的影響，分析可能的調(diào)控方式和潛在機(jī)理，為菊花花序大小的調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。【方法】使用RACE方法從菊花中克隆全長，通過DNAMAN等軟件對其序列進(jìn)行分析。采用熒光定量的方式檢測其在菊花不同器官和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)。構(gòu)建35S::-GFP融合蛋白載體進(jìn)行亞細(xì)胞定位，構(gòu)建TRV2-沉默表達(dá)載體侵染菊花。使用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析沉默系菊花表型變化，通過光學(xué)顯微鏡觀察舌狀花花瓣表皮細(xì)胞變化，使用熒光定量方式檢測相關(guān)基因在沉默系中的表達(dá)。【結(jié)果】從菊花中克隆了全長，其編碼的氨基酸序列長度為540，理論等電點(diǎn)為7.39，蛋白質(zhì)的理論分子量為60.4 kD，含有兩個(gè)AP2保守功能區(qū)域和VYL修飾位點(diǎn)。在與其他物種的ANT蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，CmANT與AtANT聚在一起。熒光定量結(jié)果表明：（1）在花蕾中的表達(dá)量最高，其次是根>莖>葉。（2）在花序不同部位的比較中，舌狀花中的表達(dá)量最高，其次是筒狀花，在花萼中的表達(dá)量最低。（3）在舌狀花中的表達(dá)隨著發(fā)育時(shí)期的延續(xù)而降低。（4）在2,4-D誘導(dǎo)下的3—6 h內(nèi)表達(dá)量持續(xù)上升。WoLF PSORT軟件預(yù)測和35S::-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位結(jié)果顯示，CmANT蛋白定位在植物細(xì)胞核中。TRV--1和TRV--2沉默系的平均花徑相比對照分別減小18.93%和27.47%，舌狀花的數(shù)目分別減少11.39%和14.66%，其中TRV--2與對照差異顯著（<0.05），筒狀花數(shù)目分別減少14.55%和36.56%。頂端花序的舌狀花平均長度分別減少34.17%和54.68%，舌狀花的寬度分別比對照減小24.05%和10.13%。葉片平均鮮重分別比對照組減小13.19%和21.98%，葉片鮮重與筒狀花數(shù)目顯著相關(guān)（<0.05）。舌狀花花瓣表皮細(xì)胞顯微觀察發(fā)現(xiàn)，沉默系舌狀花花瓣表皮細(xì)胞長度和寬度與對照差異不明顯。在兩沉默系中的表達(dá)明顯上升，在小花原基分化期時(shí)分別是對照中的1.8和1.78倍，同期的表達(dá)分別下降了32.28%和38.19%，和的表達(dá)量在多個(gè)時(shí)期也明顯降低。【結(jié)論】根據(jù)沉默系表型與相關(guān)基因的表達(dá)，推測的沉默可能解除了對抑制，促進(jìn)了生長素的轉(zhuǎn)運(yùn)和過量積累，間接抑制了的活性，限制了細(xì)胞的分裂增殖，引發(fā)細(xì)胞數(shù)目變少，導(dǎo)致沉默系器官變小。

菊花；AINTEGUMENTA；花徑；基因表達(dá)；基因沉默

0 引言

【研究意義】‘杭白菊’是中國傳統(tǒng)的菊花品種，不僅具有較高的觀賞價(jià)值，而且富含黃酮和酚酸類等營養(yǎng)物質(zhì)，成為重要的飲用保健產(chǎn)品，但由于其花序較小，限制了產(chǎn)量提高。（）對花器官的形成和大小發(fā)育具有重要作用。開展調(diào)控菊花花序生長發(fā)育的機(jī)理研究，可以為杭白菊的產(chǎn)量和品質(zhì)提高奠定理論基礎(chǔ)，對杭白菊產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】- like（）屬于（）轉(zhuǎn)錄調(diào)控家族中的亞族[1]，在模式植物擬南芥中包含、，共8個(gè)成員[2]，其序列均包含兩個(gè)AP2保守功能區(qū)域，但不含有miR172結(jié)合位點(diǎn)[3]。家族成員對于植物的生長發(fā)育調(diào)控具有重要作用，參與了胚的發(fā)育，莖的伸長，花器官發(fā)育的起始和生長等[4-5]，其中對于花器官大小的影響最為明顯[2]。缺失突變體的花器官變小，胚珠發(fā)育受損導(dǎo)致雌性不育[6-7]，而其過表達(dá)導(dǎo)致花器官增大[8]。Krizek等[9]發(fā)現(xiàn)擬南芥中生長素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因可能是的直接調(diào)控目標(biāo)，YAMAGUCHI等[10]研究表明，可以響應(yīng)生長素的誘導(dǎo)，參與了（）的表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而影響營養(yǎng)生長向開花起始的轉(zhuǎn)變，該路徑與（）平行。在花器官生長過程中，的活性受到上游生長素響應(yīng)基因（）的調(diào)控，影響花器官的大小發(fā)育[11]。除花器官發(fā)育起始和生長大小以外，Krizek等[12-13]發(fā)現(xiàn)參與的其他生理過程也與生長素有關(guān)，如花器官身份確定和雌蕊群的發(fā)育等。CHIALVA等[14]研究表明，的表達(dá)水平與葡萄果實(shí)的大小有關(guān)。植物花器官的發(fā)育由A、B、C、E四類轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因相互作用而決定[15]，能夠調(diào)控（，B類）和（，C類）的表達(dá)，影響花器官位置和大小的發(fā)育[4]，其缺失突變導(dǎo)致花器官發(fā)育紊亂。MIZUKAMI等[8]的研究認(rèn)為能夠致使器官增大的原因是其在器官形成過程中保持分生組織較強(qiáng)的分生能力，擬南芥中可能通過（）調(diào)控細(xì)胞分裂周期，使分生組織保持活力從而影響器官的大小。擬南芥中過表達(dá)導(dǎo)致葉片細(xì)胞數(shù)目變多[16]。在ant ail6雙突變體和野生型中，細(xì)胞壁重塑相關(guān)基因的表達(dá)存在較大差異[9]，HARADA等[17]證明/（）和（）參與了康乃馨花瓣的伸長過程，筆者實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)菊花中和與花瓣細(xì)胞的分裂和伸長有關(guān)。【本研究切入點(diǎn)】關(guān)于在菊花花序生長發(fā)育中的功能有待研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】使用RACE方法從菊花中克隆全長，分析其在菊花不同器官和時(shí)期以及2,4-D誘導(dǎo)下的表達(dá)特性，統(tǒng)計(jì)觀察沉默的菊花花瓣大小和形態(tài)特征，從而鑒定在菊花花序生長發(fā)育中的功能。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016—2017年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料與處理

選取長勢均勻一致的杭白菊扦插苗生根后栽培到溫室中，經(jīng)30 d長日照（16 h光照，8 h黑暗）營養(yǎng)生長后，置于短日照（8 h光照，16 h黑暗）環(huán)境中促進(jìn)其花芽分化。采取不同時(shí)期的根、莖、葉片和花器官，存儲在-80℃低溫冰箱中保存，備用。

1.2 菊花CmANT克隆

試驗(yàn)采用天根TRIzol試劑盒提取菊花花序的RNA。使用SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒（Takara，日本）反轉(zhuǎn)錄所需的cDNA一鏈。在菊花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（http://www.icugi.org/chrysanthemum/）中檢索獲得的初始中間片段。使用諾維贊高保真酶進(jìn)行5′和3′端克隆，通過DNAMAN軟件進(jìn)行全長拼接，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行全長驗(yàn)證。

1.3 生物信息學(xué)分析

通過NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的BLAST程序?qū)mANT蛋白進(jìn)行保守功能區(qū)域搜索。使用DNAMAN軟件進(jìn)行多氨基酸序列比對，在PBIL網(wǎng)站（https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home）對其信號肽等特征位點(diǎn)進(jìn)行檢測。使用Mega 7.0軟件以鄰近結(jié)合的方式構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，青蒿AaANT、向日葵HaANT、馬鈴薯StANT、棗樹ZjANT、棉花GhANT、苦瓜McANT與擬南芥AILs家族成員序列從NCBI網(wǎng)站獲得。

1.4 CmANT實(shí)時(shí)熒光定量分析

為分析在菊花不同器官中的表達(dá)情況，采取現(xiàn)蕾期（花蕾直徑約0.5 cm）菊花的根、莖段、植株中間部位的功能葉片和頂端花蕾分別進(jìn)行檢測。采取植株頂端盛花期（花序直徑約6 cm）的菊花花序，檢測在花序不同部位的表達(dá)。采取初開期（舌狀花長約1.5 cm）、盛花期（舌狀花長約2.8 cm）和衰敗期（舌狀花出現(xiàn)萎蔫變色）的舌狀花，檢測在舌狀花不同生長時(shí)期的表達(dá)。參照YAMAGUCHI等[18]的方法對營養(yǎng)生長狀態(tài)下的菊花植株噴施10 mmol?L-12,4-D，檢測在菊花頂芽中的表達(dá)量。使用菊花的作為定量的內(nèi)參基因，試驗(yàn)中所需引物見表1。使用羅氏Light Cycler 480熒光定量儀進(jìn)行PCR檢測，具體程序如下：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)2?ΔΔCt公式計(jì)算結(jié)果，通過SPSS軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差和差異顯著性。

1.5 亞細(xì)胞定位觀察

根據(jù)全長設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其編碼區(qū)序列（表1）。使用T4連接酶連接到p1258-GFP載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，測序驗(yàn)證后，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，制備菌液侵染洋蔥表皮細(xì)胞，在超高分辨率激光共聚焦顯微鏡（LSM880）下觀察拍照。

1.6 CmANT的沉默

參照Lü等[19]的方法對菊花進(jìn)行病毒誘導(dǎo)沉默。根據(jù)與轉(zhuǎn)錄組中相似基因的序列比對，篩選出的特異序列，用于沉默擴(kuò)增，所需引物見表1。將沉默所需片段連接到p-TRV2載體上，轉(zhuǎn)化到GV3101農(nóng)桿菌中，按需配制含pTRV1、pTRV2和pTRV2-質(zhì)粒的混合侵染液。將扦插生根后的菊花幼苗分為兩組進(jìn)行侵染，一組由含有pTRV1和pTRV2空載的農(nóng)桿菌侵染，作為對照；一組由含有pTRV1和pTRV2-的農(nóng)桿菌侵染，每組處理50株菊花。經(jīng)真空負(fù)壓侵染后置于黑暗條件中2 d，然后轉(zhuǎn)移到溫室長日照（光照16 h，黑暗8 h）環(huán)境中培養(yǎng)30 d，后轉(zhuǎn)移到短日照（光照8 h，黑暗16 h）環(huán)境中促進(jìn)其花芽分化。采取小花原基分化期的花芽，初開期和盛花期的花序，通過半定量PCR的方式檢測病毒誘導(dǎo)基因沉默效果。采集沉默系與TRV對照組菊花花序和葉片進(jìn)行形態(tài)特征調(diào)查分析。

1.7 沉默系的表型性狀觀察

采取沉默系和TRV對照組的盛花期花序和葉片，調(diào)查花序直徑、舌狀花和筒狀花數(shù)目、舌狀花的長度和寬度，稱量所有葉片鮮重。使用IBM SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，花器官形態(tài)使用數(shù)碼相機(jī)拍照。制作舌狀花花瓣中部上表皮細(xì)胞切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，隨機(jī)選取視野中9個(gè)細(xì)胞，測量記錄其長度和寬度，使用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 CmANT相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量分析

在菊花轉(zhuǎn)錄組中檢索調(diào)控相關(guān)的基因序列，設(shè)計(jì)定量引物（表1）。根據(jù)文獻(xiàn)查閱和預(yù)試驗(yàn)檢測，采取沉默系和對照組菊花的小花原基分化期（短日照處理14 d）花芽[20]，初開期和盛花期的內(nèi)外輪舌狀花，參照1.4的方法進(jìn)行熒光定量檢測。

表1 相關(guān)基因試驗(yàn)所用引物序列

2 結(jié)果

2.1 菊花CmANT克隆與序列分析

根據(jù)擬南芥中序列在菊花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的blast結(jié)果，篩選出相近的基因中間片段，通過RACE克隆的方法獲得全長序列，共1 995 bp，將其序列提交到NCBI基因庫中，命名為，登錄號為：KY315243。使用DNAMAN軟件預(yù)測，發(fā)現(xiàn)編碼540個(gè)氨基酸，其理論等電點(diǎn)為7.39，蛋白質(zhì)的理論分子量為60.4 kD。

2.2 ANT氨基酸序列比對分析

通過NCBI網(wǎng)站BLAST搜索相似蛋白序列，獲得了其他物種的ANT蛋白，其中CmANT與青蒿的AaANT相似度最高，為80.78%，由于擬南芥中AtANT的氨基酸序列研究較為深入，所以將菊花的CmANT與其進(jìn)行詳細(xì)序列比對（圖1），兩者的相似度為39.97%。對CmANT結(jié)構(gòu)分析表明，在中間部位有兩個(gè)AP2/ERF家族特有的AP2保守功能區(qū)域，是AP2-like亞族區(qū)別于ERF-like亞族的重要特征[21]。兩個(gè)AP2保守區(qū)域之間有29個(gè)氨基酸組成的連接區(qū)域[22]。此外，CmANT含有與轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)的VYL修飾位點(diǎn)[23]。

兩個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域由下劃線標(biāo)示，VYL修飾位點(diǎn)由黑色三角標(biāo)示

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步確認(rèn)CmANT的身份，將菊花的CmANT與其他物種的ANT蛋白以及擬南芥的8個(gè)AtAIL蛋白成員一起通過Mega 7.0軟件以鄰近結(jié)合的方式構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果顯示菊花的CmANT與青蒿的AaANT聚在一組（圖2），兩者的遺傳距離更為接近。此外，各物種的ANT蛋白聚在一起，與擬南芥的其他AIL成員遺傳距離較遠(yuǎn)。由此說明，CmANT為菊花中的ANT蛋白。

2.4 菊花CmANT在菊花中的表達(dá)

通過熒光定量的方式檢測在菊花不同器官中的表達(dá)（圖3-A），發(fā)現(xiàn)在莖和葉中的表達(dá)量較低，在花蕾中的表達(dá)量最高，是葉中的16.21倍，同時(shí)在根中也有相當(dāng)較高的表達(dá)，是葉中的8.28倍。比較在菊花花序不同部位中的表達(dá)（圖3-B），發(fā)現(xiàn)其在花萼中的表達(dá)量最低，在筒狀花中次之，在舌狀花中的表達(dá)量最高，是花萼中的10.46倍。本試驗(yàn)進(jìn)一步檢測了在舌狀花不同生長時(shí)期的表達(dá)（圖3-C），結(jié)果表明在衰老期的表達(dá)量最低，在初開期和盛花期均有較高的表達(dá)量，分別是衰老期的14.25和8.45倍。是生長素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中重要的響應(yīng)基因[10]，參照YAMAGUCHI等[18]的方法，檢測了在2,4-D誘導(dǎo)下的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量在經(jīng)2, 4-D處理3 h后上升了4.64倍，在6 h后仍持續(xù)上升，是對照的7.49倍（圖3-D）。

2.5 菊花CmANT表達(dá)載體的構(gòu)建與亞細(xì)胞定位

經(jīng)WoLF PSORT軟件預(yù)測，發(fā)現(xiàn)CmANT蛋白定位在植物細(xì)胞核中。根據(jù)全長設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其編碼區(qū)序列，連接到p1258-GFP過表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化到土壤農(nóng)桿菌中侵染洋蔥表皮細(xì)胞，使用475 nm藍(lán)光激發(fā)，發(fā)現(xiàn)綠色熒光聚集在細(xì)胞核區(qū)域，表明CmANT蛋白主要定位在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中。兩種方法的結(jié)果互相吻合（圖4），說明CmANT蛋白的作用區(qū)域可能更多集中在細(xì)胞核中。

圖2 AILs蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

A：CmANT在菊花不同器官中的表達(dá)；B：CmANT在菊花花序不同部位的表達(dá)；C：CmANT在不同生長期的舌狀花中表達(dá)；D：CmANT在2,4-D誘導(dǎo)下的表達(dá)。誤差線代表3個(gè)生物學(xué)重復(fù)計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)誤差。不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

2.6 菊花CmANT沉默的菊花花序和葉片

通過半定量PCR方式檢測在各株系小花原基分化期花芽中的表達(dá)，鑒定出6個(gè)TRV-沉默株系，選擇表型變化最為明顯的TRV--1和TRV--2進(jìn)行下一步研究，并在初開期和盛花期時(shí)持續(xù)檢測沉默效果（圖5）。

A、D為綠色熒光下的圖片，B、E為明場下的圖片，C、F為疊加下的圖片

TRV--1和TRV--2沉默系中花序直徑與TRV對照組差異明顯（＜0.01），分別減小了18.93%和27.47%（圖6-A，表2）。舌狀花的數(shù)目分別減少了11.39%和14.66%，其中TRV--2與對照差異顯著（＜0.05），而筒狀花的數(shù)目變化更為明顯，分別減少了14.55%和36.56%。舌狀花的大小對菊花花序直徑具有重要影響，本試驗(yàn)采集了各株系頂端花序的內(nèi)、外輪舌狀花進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)分析（圖6-B，表2），發(fā)現(xiàn)兩株沉默系的舌狀花平均長度與對照相比差異顯著（＜0.01），分別減少了34.17%和54.68%；舌狀花的寬度分別比對照減小了24.05%和10.13%。

圖5 CmANT在不同沉默系和TRV對照組小花原基分化期花芽中的表達(dá)

舌狀花大小的變化可能源自細(xì)胞體積和數(shù)目的改變，為進(jìn)一步研究TRV-沉默株系舌狀花花瓣變小的原因，本試驗(yàn)采集了體積差異明顯的沉默系和對照組舌狀花，制備花瓣中部表皮細(xì)胞玻片，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)（圖6-C，表2），發(fā)現(xiàn)兩個(gè)TRV-沉默株系的表皮細(xì)胞長度和寬度與對照組差異不明顯。說明的沉默并沒有引起花瓣表皮細(xì)胞的體積變化，推測舌狀花花瓣變小的原因可能是由于花瓣細(xì)胞數(shù)目的改變。菊花的營養(yǎng)對花序的發(fā)育具有重要影響，本試驗(yàn)初步檢測了作為主要營養(yǎng)供應(yīng)的葉片的鮮重（表2），發(fā)現(xiàn)沉默系中葉片平均鮮重分別比對照組減小了13.19%和21.98%，但差異不顯著（＞0.05）。進(jìn)一步通過SPSS軟件了解其與花序各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)葉片鮮重與筒狀花數(shù)目顯著相關(guān)（＜0.05），而與其他指標(biāo)的相關(guān)性均不顯著（表2），說明沉默系中筒狀花數(shù)目的改變可能與葉片鮮重存在一定關(guān)系，而其他花器官指標(biāo)的變化大多與葉片改變關(guān)系可能不大。

2.7 CmANT及其相關(guān)基因在菊花沉默系中的表達(dá)

在對照組的小花原基分化期時(shí)表達(dá)量最高，初開期時(shí)有所下降，盛花期時(shí)表達(dá)量最低；在TRV--1和TRV--2沉默系中在小花原基分化期和初開期時(shí)的表達(dá)量極顯著低于對照組（＜0.01），在盛花期時(shí)，TRV--2沉默系與對照組也有顯著差異（＜0.05）。說明在兩個(gè)沉默系的表達(dá)受到了明顯抑制。在TRV--1和TRV--2沉默系中各時(shí)期的表達(dá)均高于對照組，在小花原基分化期時(shí)差異最為顯著（＜0.05），分別是對照中的1.8和1.78倍，而表達(dá)的改變可能會影響生長素的運(yùn)輸和積累。在兩個(gè)沉默株系中的表達(dá)均比對照中低，如在小花原基分化期時(shí)分別下降了32.28%和38.19%，說明的沉默影響了的表達(dá)。在初開期時(shí)分別減少了27.76%和29.88%，在初開期時(shí)分別比對照降低了37.03%和33.78%（圖7）。和的表達(dá)降低，從側(cè)面說明沉默系中花瓣細(xì)胞的分裂活動可能受到了影響。

A：花序，B：舌狀花，C：舌狀花花瓣表皮細(xì)胞，I：TRV對照組，II：TRV-CmANT-1沉默系，III：TRV-CmANT-2沉默系，Bar=25 μm

表2 CmANT沉默系與對照組菊花花序形態(tài)指標(biāo)

表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。每一行中*代表在＜0.05水平上與對照相比有顯著差異，**代表在＜0.01水平上有顯著差異

Values are mean ± SE. In each line, * indicates statistically significant differences at＜0.05, ** indicates statistically significant differences at＜0.01

3 討論

CmANT氨基酸序列中含有AILs家族中保守的兩個(gè)AP2功能區(qū)域，前人研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)AP2區(qū)域會同時(shí)作用于ANT和靶基因的結(jié)合[24]，CmANT的第一個(gè)AP2功能域中含有與轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)的VYL修飾位點(diǎn)，說明菊花的CmANT可能與AtANT類似，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。

3.1 菊花CmANT表達(dá)特性

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在花蕾中的表達(dá)量最高，說明其可能更多的調(diào)控花器官的發(fā)育，但也參與了根、莖、葉等營養(yǎng)器官的生長。MIZUKAMI等[8]研究證明能夠保持細(xì)胞的分生能力，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的持續(xù)增殖，調(diào)控器官不斷生長。比較在菊花不同時(shí)期舌狀花中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)量隨著舌狀花發(fā)育的持續(xù)而降低，推測可能是由于初開期的舌狀花處于快速生長期，伴隨著大量細(xì)胞的生長和增殖，的高表達(dá)可能會維持此時(shí)細(xì)胞增殖所需的能力，而衰老期時(shí)舌狀花幾乎停止了生長，細(xì)胞生長和增殖的需求較小，所以的表達(dá)量較低。同理，在初開期花序的不同部位中，舌狀花的數(shù)量較多，生長發(fā)育較快，需要的高表達(dá)來實(shí)現(xiàn)其較大的生長需求，其次是筒狀花和花萼。在生長素調(diào)控花序發(fā)育的代謝網(wǎng)絡(luò)中，生長素與受體結(jié)合促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄抑制蛋白AUX/IAAs的降解，解除了對轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AUXIN- RESPONSE FACTORs（ARFs）的抑制[25-26]，其中ARF MONOPTEROS（MP/ARF5）能夠直接激活的表達(dá)[18]。本試驗(yàn)中，的表達(dá)在菊花經(jīng)2,4-D處理3—6 h內(nèi)出現(xiàn)快速響應(yīng)而持續(xù)上升，說明可能受到生長素含量的間接調(diào)控。通過35S::- GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，熒光信號聚集在細(xì)胞核中，這可能與CmANT作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的性質(zhì)有關(guān)，在細(xì)胞核中實(shí)現(xiàn)對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

相鄰列中*代表在＜0.05水平上與TRV對照相差異顯著，**代表在＜0.01水平上差異顯著

* indicates statistically significant differences at＜0.05 compared with TRV control among adjacency lists, ** indicates statistically significant differences at＜0.01

圖7及其相關(guān)基因在沉默系和對照中的表達(dá)

Fig. 7 Expression ofand related genes in silenced and control chrysanthemum

3.2 CmANT沉默對菊花花序和葉片的影響

通過構(gòu)建TRV-沉默表達(dá)載體侵染菊花進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)TRV--1和TRV--2沉默株系的花序平均直徑相比TRV對照組明顯減小。而在擬南芥強(qiáng)突變體中，不僅花器官的體積變小，同時(shí)出現(xiàn)了外輪花瓣和雄蕊的數(shù)量減少[7]，NOLE-WILSON等[27]發(fā)現(xiàn)突變體中分生組織細(xì)胞的不足導(dǎo)致形成的花器官原基比野生型要小，進(jìn)而可能使花器官數(shù)目減少。雖然本試驗(yàn)沉默系中未發(fā)現(xiàn)菊花單個(gè)小花的器官缺失，但舌狀花和筒狀花數(shù)目均明顯減少，說明的沉默可能會影響菊花小花原基的分化，影響小花數(shù)目。筒狀花數(shù)目減少的幅度要大于舌狀花，可能是由于筒狀花相比舌狀花在小花原基分化時(shí)發(fā)育較晚的緣故，因此筒狀花數(shù)目的改變更為明顯。對舌狀花觀察統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，其平均長度和寬度較對照組明顯變小，通過對花瓣表皮細(xì)胞的顯微觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的長度和寬度與對照相比無明顯變化，類似的是擬南芥突變體的葉片和花瓣表皮細(xì)胞體積沒有變小，反而異常變大[8]。排除細(xì)胞體積的變化的因素，則引起花瓣變小的原因可能是細(xì)胞數(shù)目的減少，因此推測的沉默可能會影響花瓣細(xì)胞的增殖，進(jìn)而影響花瓣的大小。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默系葉片平均鮮重明顯小于對照組，說明的沉默也會對葉片產(chǎn)生類似的影響。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)除筒狀花數(shù)目以外，花序其他指標(biāo)與葉片的相關(guān)性不明顯，推測沉默系中花序的改變除部分來自葉片營養(yǎng)供應(yīng)的差異外，可能更多的是由于的沉默。

3.3 CmANT調(diào)控花序生長發(fā)育機(jī)理的分析

是調(diào)控細(xì)胞分裂起始的重要基因，主要在花器官中表達(dá)[28]，擬南芥中過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目變多[16]。MIZUKAMI等[8]發(fā)現(xiàn)擬南芥中過表達(dá)使在成熟葉片中持續(xù)表達(dá)，在突變體中卻沒有表達(dá)，認(rèn)為可能會直接調(diào)控的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的持續(xù)分裂。但RANDALL等[29]的研究表明的啟動子序列與AtANT并無直接互作關(guān)系，并推測與在調(diào)控器官生長過程中是獨(dú)立運(yùn)行的。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在的沉默系中的表達(dá)有所降低，推測可能會以間接的方式影響的表達(dá)。在沉默系的小花原基分化時(shí)，的表達(dá)降低可能會限制分生組織的細(xì)胞分裂，影響小花的數(shù)目，尤其是發(fā)育較晚的筒狀花。是重要的生長素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，影響側(cè)生器官的生長發(fā)育[30]，可能受到的直接調(diào)控[9]。在擬南芥雙突變體中，發(fā)現(xiàn)雖然花器官的發(fā)育受阻，但有更多的生長素積累[9]。在本試驗(yàn)中，在兩個(gè)沉默系中的表達(dá)均明顯上升，所以猜測可能是負(fù)向調(diào)控的轉(zhuǎn)錄抑制因子，的沉默導(dǎo)致抑制減弱，而激活了的表達(dá)，進(jìn)而可能會促進(jìn)生長素的積累。Garza- AGUILAR等[31]的研究表明在IAA處理過的玉米種子萌發(fā)過程中，CYCD3;1蛋白含量降低，同時(shí)相關(guān)蛋白激酶的活性也有所改變，因此推測持續(xù)過高濃度的生長素含量對的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和相關(guān)激酶的活性可能具有抑制作用。另一方面，植物體內(nèi)激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在交叉聯(lián)系和相互影響[32]，誘導(dǎo)的生長素積累，可能會對其他激素的代謝網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生影響，如擬南芥雙突變體花器官中不僅生長素大量積累，同時(shí)伴隨著其他激素含量的改變[21]，這些激素的代謝紊亂可能會對產(chǎn)生影響，抑制其轉(zhuǎn)錄表達(dá)或者蛋白激酶活性。因此也有可能是菊花的沉默激活了的表達(dá)，造成花序中的激素代謝紊亂，對的表達(dá)產(chǎn)生了間接影響，抑制了其活性，導(dǎo)致細(xì)胞分裂受阻。PEAUCELLE等[33]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁中果膠成分的改變，引起細(xì)胞壁的松散，有利于側(cè)生器官的起始發(fā)育，而引起的生長素積累，調(diào)控一系列細(xì)胞壁重塑相關(guān)基因的表達(dá)，如和。Harada等[17]證明了和參與了康乃馨花瓣的伸長生長。本試驗(yàn)中，和在兩個(gè)沉默系中的表達(dá)均有所降低。因此推測的沉默可能間接的降低了細(xì)胞壁重塑基因的表達(dá)，限制了細(xì)胞壁的舒張，影響了花器官分生組織的發(fā)育，也有可能是的沉默導(dǎo)致細(xì)胞分裂活動的降低，減少了細(xì)胞壁重塑相關(guān)蛋白的需求，從而影響了和的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，本研究更傾向于后者。

4 結(jié)論

本研究克隆的具有典型AP2家族序列特征，在花蕾和初開期的舌狀花中具有較高的表達(dá)。的沉默導(dǎo)致花序直徑、小花數(shù)目和舌狀花的體積明顯變小，推測原因是由于對抑制的解除，促進(jìn)了生長素的轉(zhuǎn)運(yùn)而過量積累，間接抑制了的活性，限制了細(xì)胞的分裂增殖，以致細(xì)胞數(shù)目變少，伴隨著細(xì)胞壁的重塑活動，從而影響器官的生長。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Cloning and Functional Verification ofGene in Chrysanthemum

WEN LiZhu, SUN Xia, Fan HongMei, GUO YunHui, YU YuanYuan, REN Hong, WANG WenLi, ZHENG ChengShu

(College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/Chrysanthemum Research Center of China, Japan and Korea in Shandong Province, Tai’an 271018, Shandong)

【Objective】 To understand the role ofgene in chrysanthemum inflorescence development, we clonedgene from chrysanthemum, analyzed its sequence, and characterized its temporal and spatial expression pattern. We further analyzed the impact ofsilence on inflorescence development and its possible regulation mode. This study was carried to reveal the potential mechanism ofin governing inflorescence development, which in turn can provide a theoretical basis for chrysanthemum inflorescence diameter adjustment. 【Method】 The chrysanthemumgene was cloned by RACE method and its sequence was analyzed with DANMAN software. Its expression in different developmental stages and organs of chrysanthemum was detected by real-time fluorescent quantitation PCR. The plasmid of 35S::-GFP was constructed for the subcellular localization. The silence vector of TRV2-was constructed to infect chrysanthemums. The statistics of phenotypic changes insilenced chrysanthemums were analyzed via SPSS software. The ray florets petal epithelial cells were observed with optical microscope. The expression ofand related genes were detected by real-time fluorescent quantitation PCR. 【Result】 The full-length ofwas cloned from chrysanthemum. It encodes 540 amino acids and contains two AP2 conserved function domains and VYL modification sites. The theoretical isoelectric point of CmANT is 7.39 and its molecular weight is 60.4 kD. The phylogenetic tree composed of ANT proteins from various plants species showed that CmANT and AaANT had been grouped together. The real-time fluorescent quantitation results showed that: (1)was expressed most in floral buds, followed by roots, stems and leaves. (2) Gene expression in different parts of inflorescence indicated thatwas expressed the most in ray florets followed tubular florets and the lowest in the sepal. (3) The expression ofdeclined during the development of ray florets. (4) The expression ofunder 2,4-D treatment increasedbetween 3 h to 6 h. WoLF PSORT prediction and 35S::-GFP fusion protein localization in onion epithelial cells indicated that CmANT protein was located in cell nucleus. Compared with the control, the mean inflorescence diameters of chrysanthemums in TRV--1 and TRV--2 lines were decreased by 18.93% and 27.47% respectively and the numbers of ray florets were decreased by 11.39% and 14.66% respectively, among which the difference between TRV--2 lines and the control was statistically significant (＜0.05 ). The numbers of tubular florets were decreased by 14.55% and 36.56%, the mean length of ray florets in top inflorescences was decreased by 34.17% and 54.68%, and the width was decreased by 24.05% and 10.13% respectively in TRV--1 and TRV--2 lines compared with the control, the mean fresh weight of leaves was decreased by 13.19% and 21.98% respectively in TRV--1 and TRV--2 lines and the correlation between leaf fresh weight and tubular floret number was significant (＜0.05 ). The microscopic observation of epithelial cells in ray floret petals indicated that the cell length and width of petals in the silenced lines and the control had no visible differences. The expression ofwas decreased by 32.28% and 38.19% in two silenced lines and the expression ofandalso decreased at most developmental stages. 【Conclusion】Due to the phenotypic changes andexpression pattern in silenced chrysanthemums lines, we speculated that the silence ofmight relieve the repression on, facilitate the transport and accumulation of auxins, indirectly repress the activation of, limit the cell division, and cause the decrease of cell number, combined of which would eventually lead to the smaller organ sizes in silenced chrysanthemums lines.

;; inflorescence diameter; gene expression; gene silence

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.014

2017-09-20；

2017-12-20

國家科技支撐計(jì)劃（2011BAD10B07）、國家自然科學(xué)基金面上基金（31670663）

溫立柱，E-mail：wlizhu@163.com。孫霞，E-mail：sunxia65@sina.com。溫立柱與孫霞為同等貢獻(xiàn)作者。

鄭成淑，Tel：0538-8246139；E-mail：zcs@sdau.edu.cn