超高效液相色譜-串聯質譜法測定飼料中的二氫吡啶

肖志明，王峻，索德成，魏書林，賈錚，劉成新，樊霞

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超高效液相色譜-串聯質譜法測定飼料中的二氫吡啶

肖志明1，王峻2，索德成1，魏書林1，賈錚1，劉成新1，樊霞1

（1中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所 國家飼料質量監督檢驗中心（北京），北京 100081；2湖北省獸藥監察所，武漢 430070）

【目的】二氫吡啶是一種新型的飼料添加劑，具有促進動物生長、提高飼料利用率、改善肉質等功效，目前已在畜牧生產中得到廣泛應用。然而，二氫吡啶并不是允許使用的藥物飼料添加劑，其在飼料中高水平添加所帶來的畜產品中二氫吡啶殘留可引起敏感人群嚴重的低血壓反應。央視3.15晚會曝光了部分飼料企業違規使用二氫吡啶、硫酸黏桿菌素、喹乙醇等獸藥，引起社會的廣泛關注和政府的高度重視，因而亟需建立飼料中二氫吡啶的檢測方法，為飼料企業合理用藥和政府監管提供必要的技術支撐?！痉椒ā坎捎肬PLC上常用的BEH C18色譜柱，分別使用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸作為流動相，優化了不同組成和比例流動相對色譜分離和質譜電離的影響。在正離子模式下進行母離子掃描，確定準分子離子，優化儀器毛細管電壓、錐孔電壓、霧化氣流速等參數；然后進行子離子掃描，優化碰撞能量、駐留時間等參數，以確定豐度較高的兩個子離子作為定性離子，并選擇其中豐度最高的作為定量離子。比較甲醇、乙腈等不同溶劑對提取效率的影響，以及C18、HLB、MCX和堿性氧化鋁等固相萃取柱（SPE）對凈化效果的影響，確定較優的樣品前處理方法。【結果】優化確定了較佳的前處理方法：采用乙腈超聲提取，提取液在60℃下氮氣吹干，殘余物用乙腈﹕水（1﹕9，v/v）復溶，過HLB固相萃取柱凈化，用乙腈﹕水（9﹕1，v/v）洗脫，洗脫液過0.22 μm有機濾膜后上超高效液相色譜-串聯質譜儀（UPLC-MS/MS）測定。采用電噴霧離子源，在多反應監測（MRM）模式下，二氫吡啶的[M+H]+為254，失去乙氧基（CH3-CH2-O+，46 Da）后產生主要的碎片離子208，208脫掉羰基（C=O，28 Da）產生碎片離子180，180進一步脫去乙酯基（CO-O-CH2-CH3，73 Da）后得到碎片離子108，因此本研究以離子對254＞208為定量離子，254＞180為定性離子。以0.1%的甲酸水-乙腈為流動相進行梯度洗脫，在10 min內完成了二氫吡啶的分離，且峰形尖銳，靈敏度高。二氫吡啶在0—500 μg·L-1濃度范圍內呈現良好的線性關系（R≥ 0.9992），根據20個空白樣品的基線噪音，取其平均值，以信噪比（S/N）=3為檢出限（LOD），S/N=10為定量限（LOQ），二氫吡啶的LOD、LOQ分別為10和50 μg·kg-1。在10、50和100 μg·kg-1三個添加水平下，二氫吡啶的平均回收率為82.6%—101.0%，日內變異系數為0.8%—6.7%，日間變異系數為4.7%—9.2%。【結論】該方法操作簡便、快速、穩定，適用于飼料中二氫吡啶的日常監測。

超高效液相色譜；串聯質譜；飼料；二氫吡啶

0 引言

【研究意義】二氫吡啶類藥物屬于鈣通道阻滯劑類（calcium channel blocker）降血壓藥，是能夠在通道水平上選擇性地阻滯鈣離子進入細胞內，進而減少細胞內鈣離子濃度的一類具有廣泛心血管藥理作用的藥物，目前在醫學臨床上主要用于治療高血壓、心律失常、心絞痛、心力衰竭等心腦血管疾病[1-3]。20世紀70年代前蘇聯科學家KLUSA等發現二氫吡啶具有促進畜禽生長的作用，此后世界各國相繼展開了相關研究[4-6]。需要注意的是，各大媒體及文獻資料中普遍使用的“二氫吡啶（diludine）”其化學名稱實際為“2,6-二甲基-3,5-二乙酯基-1,4-二氫吡啶（2,6-dimethyl-3,5-dicarboxy-1,4-dihydropyridine）”，本文研究的即為該物質。由于其化學名稱較為冗長，因此媒體往往簡稱其為“二氫吡啶”，但二者其實是完全不同的兩種化學物質（表1）。二氫吡啶的生理作用主要表現在抗氧化、促進動物消化吸收、調節動物內分泌、增強免疫力等方面[7-9]。目前，二氫吡啶已作為一種新型的飼料添加劑在畜牧生產中廣泛用于改善肉質、促進動物生長、提高飼料利用率、提高家禽產蛋率、增強動物繁殖性能、抗應激等方面，還可用于防治奶牛乳房炎、脂肪肝等疾病[10-18]。此外，二氫吡啶能夠有效降低飼料中維生素A、維生素E、胡蘿卜素等營養物質的氧化損失，顯著提高其利用率[19-22]。然而，經查詢“二氫吡啶”并未列入農業部規定的允許使用物質三大目錄——《飼料原料目錄》、《飼料添加劑品種目錄》和《藥物飼料添加劑品種目錄》，因此其在飼料中添加使用屬于違法行為。且二氫吡啶的添加濃度往往較高，如在育肥豬飼料中推薦添加量為50 mg·kg-1時可顯著促進育肥豬的生長發育，如此高水平的添加所帶來的畜產品中二氫吡啶殘留可能引起敏感人群嚴重的低血壓反應。央視3.15晚會曝光了部分飼料企業違規使用二氫吡啶、硫酸黏桿菌素、喹乙醇等藥物，引起社會的廣泛關注和政府的高度重視，然而目前尚無二氫吡啶的檢測方法標準，難以對其進行有效監管?！厩叭搜芯窟M展】目前，國內外關于二氫吡啶的檢測方法鮮有報道。經查詢僅金甌等[23]建立了二氫吡啶及其雜質含量的高效液相色譜測定方法，以優化二氫吡啶的生產工藝。該方法僅可用于純品的檢測，并不適用于飼料等復雜基質中二氫吡啶的測定。【本研究切入點】目前，關于飼料中二氫吡啶的檢測方法尚未見報道，這在一定程度上制約了飼料企業合理使用藥物飼料添加劑，也限制了政府部門對其進行有效監管，尤其是在3.15晚會曝光之后，亟需飼料中二氫吡啶的檢測方法?！緮M解決的關鍵問題】本研究旨在建立一種準確、快速、靈敏測定飼料中二氫吡啶的UPLC-MS/MS方法，為飼料企業合理使用藥物飼料添加劑以及為政府監管提供必要的技術支撐。

1 材料與方法

試驗于2017年3—6月在中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所國家飼料質量監督檢驗中心（北京）進行。

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity超高效液相色譜儀-串聯XEVO TQ質譜儀，配備電噴霧離子源（ESI），Masslynx 4.1工作站（美國Waters公司）；3K15高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；氮吹儀（日本EYELA公司）；Milli-Q超純水儀（美國Milli-Q公司）；BS 210S 分析天平（德國Sartorius 公司）；ZM 100旋風磨（德國Retsch公司）；MS2 Minishaker旋渦振蕩器（德國IKA公司）；超聲波清洗儀（美國Crest公司）；臺式搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）。

表1 二氫吡啶的化學結構式

2,6-二甲基-3,5-二乙酯基-l,4-二氫吡啶標準品（純度≥99%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；乙腈、甲醇和甲酸均為色譜純，購自美國Fisher公司；試驗用水為Milli-Q制備的超純水；Oasis HLB固相萃取柱（60 mg/3cc，美國Waters公司）；飼料樣品由國家飼料質量監督檢驗中心（北京）提供。

1.2 標準溶液

精確稱取適量二氫吡啶標準品，用乙腈溶解并定容，配置成濃度為1 000 μg·mL-1的標準儲備溶液，置于-20℃冰箱避光保存，有效期6個月；準確移取1.0 mL標準儲備液于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配置成10 μg·mL-1的標準工作液，4℃冰箱避光保存，有效期1個月。使用時用流動相（0.1%甲酸-乙腈，90﹕10，v/v）逐級稀釋，配置成濃度為10—500 μg·L-1的系列標準溶液，該標準系列溶液需現用現配。

1.3 樣品前處理

樣品提?。簻蚀_稱取經粉碎過40目篩（0.45 mm孔徑）的配合料、濃縮料、精料補充料、添加劑預混料等飼料樣品2.0 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，加入乙腈20 mL，旋渦混勻30 s，置于超聲波水浴中超聲提取15 min。取出4℃下10 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液在氮吹儀上60℃下吹干，殘余物用3 mL乙腈﹕水（1﹕9，v/v）復溶，旋渦1 min使其充分溶解，備用。

凈化：HLB SPE柱預先用3 mL乙腈、3 mL乙腈﹕水（1﹕9，v/v）活化，取備用液過柱，用3 mL乙腈﹕水（1﹕9，v/v）淋洗，減壓抽干，用2 mL乙腈﹕水（9﹕1，v/v）洗脫，收集洗脫液，過0.22 μm有機濾膜后供UPLC-MS/MS測定。

1.4 儀器分析

色譜條件：Waters ACQUITY BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫35℃；進樣室溫度4℃；進樣體積10 μL；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈，流速0.3 mL·min-1，梯度洗脫條件見表2。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描（ESI+），多反應監測模式（MRM）；脫溶劑氣為高純氮氣，流速800 L·h-1；碰撞氣為高純氬氣，流速0.13 mL·min-1，使用前調節各氣體流量以使質譜靈敏度達到最優狀態。二氫吡啶的定量離子對為254＞208，錐孔電壓15 V，碰撞能量為10 eV；定性離子對為254＞180，錐孔電壓15 V，碰撞能量為15 eV，駐留時間（Dwell time）均為0.1 s。

2 結果

2.1 基質添加標準曲線

取空白飼料樣品按照1.3所述方法進行樣品提取和凈化，用洗脫液配制二氫吡啶標準曲線，使其濃度分別為0、10、20、50、100、500 μg·L-1，進UPLC-MS/MS測定。以基質添加標準工作液的濃度為橫坐標，定量離子的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。各飼料樣品的基質匹配標準曲線見表3，相關系數均大于0.999，表明方法線性關系良好。

2.2 方法的選擇性、檢出限和定量限

隨機抽取不同來源的20份飼料樣品（包括豬配合料5份、雞配合料2份、魚配合料2份、豬濃縮料5份、牛精料補充料2份、羊精料補充料1份、添加劑預混料3份），按照1.3和1.4所述方法進行樣品處理和測定，代表性的空白及添加樣品色譜圖如圖1所示，在目標化合物提取離子的保留時間內沒有干擾峰的出現，表明該方法的選擇性良好。根據20個空白樣品的基線噪音，取其平均值，以信噪比（S/N）=3為檢出限（limits of detection，LOD），S/N=10為定量限（limits of quantification，LOQ），二氫吡啶的LOD、LOQ分別為10和50 μg·kg-1（表3）。

2.3 準確度、精密度和重現性

選擇具有代表性的飼料樣品，包括豬配合料、豬濃縮料、牛精料補充料和添加劑預混料進行添加回收試驗，按照1.3和1.4所述方法進行樣品處理和測定，方法的準確度、精密度和重現性見表4，代表性的空白和添加樣品色譜圖見圖1。由表4可知，對于飼料樣品，二氫吡啶的平均回收率在82.6%—101.0%之間，日內變異系數在0.8%—6.7%之間，日間變異系數在4.7%—9.2%之間。

表2 流動相梯度洗脫條件

表3 基質添加標準曲線的線性方程和相關系數

圖1 添加飼料樣品（A，50 μg·kg-1）及空白樣品（B）色譜圖

表4 飼料樣品添加二氫吡啶的回收率和變異系數

3 討論

3.1 UPLC-MS/MS條件優化

本研究使用UPLC上常用的BEH C18色譜柱，分別采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸作為流動相，考察不同組成和比例流動相對色譜分離和質譜電離的影響。結果表明，流動相中添加甲酸后二氫吡啶的信號強度明顯提高，甲醇和乙腈作為流動相對信號強度的影響并不大，但采用乙腈作為流動相時二氫吡啶的峰形更加尖銳。

質譜條件優化過程中，本研究首先采用濃度為1.0 μg·L-1的二氫吡啶標準溶液上UPLC-MS/MS測定，在正離子模式下進行母離子掃描，確定準分子離子，優化儀器毛細管電壓、錐孔電壓、霧化器流速等參數。然后進行子離子掃描，優化碰撞能量、駐留時間等參數，確定豐度較高的兩個子離子作為定性離子，并選擇其中豐度最高的作為定量離子。

3.2 二氫吡啶的MS/MS裂解規律

二氫吡啶在正離子模式下的靈敏度最高，在ESI離子源電離后，獲得了質子化的準分子離子，即[M+H]+，準分子離子在碰撞室發生裂解，圖2展示了二氫吡啶的主要碎片離子質譜圖及可能的裂解途徑。二氫吡啶的[M+H]+為254，失去乙氧基（CH3-CH2-O+，46 Da）后產生主要的的碎片離子208，208脫掉碳氧基（C=O，28 Da）產生碎片離子180，180進一步脫去乙酯基（CO-O-CH2- CH3，73 Da）后得到碎片離子108。

圖2 二氫吡啶的子離子掃描色譜圖及可能的裂解途徑

3.3 樣品前處理條件的優化

在藥物殘留分析中甲醇、乙腈是最為常用的提取溶劑，因此本研究首先對甲醇、乙腈的提取效果進行了比較，結果顯示二者提取效率相當，均能夠有效提取飼料中的二氫吡啶。但由于飼料樣品含有大量豆粕、玉米、棉粕、魚粉等蛋白質原料，考慮到乙腈具有較好的沉淀蛋白效果，因此本研究最終使用乙腈作為提取溶劑。

飼料樣品基質極其復雜，添加有大量蛋白質、維生素、氨基酸、礦物質等原料，選擇合適的凈化方式是確保檢測方法穩定可靠的前提[24]。固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）是目前最為常用的凈化方法，與傳統液-液萃取相比，SPE具有凈化效果好、回收率高、重現性好、所需有機試劑少等優點[25-27]。本研究比較了藥物檢測中常用的C18、HLB、MCX和堿性氧化鋁SPE柱，最終選擇了具有雙親性的Oasis HLB柱。HLB使用親水-親酯的共聚物作為填料，載樣量是普通C18的3倍左右，并且具有極好的重現性。一般的C18SPE柱在上樣和淋洗的過程中必須保持濕潤，不能干涸，否則柱填料容易出現細微的不易察覺的裂痕，會嚴重影響目標化合物的回收率和重現性，而Oasis HLB柱的雙親性共聚物填料克服了這個問題，使用起來更為方便[28]。

本研究首先采用Waters推薦的處理方法，即用乙腈/水（5﹕95，v/v）為上樣液，100%乙腈為洗脫液。采用此法基質干擾較為嚴重，UPLC-MS/MS質量離子色譜圖上出現了雜質干擾峰。為了排除基質干擾，本法在推薦方法的基礎上進一步進行了優化，對二氫吡啶在HLB柱上的洗脫曲線進行了研究。取空白樣品按照1.3進行提取，提取液加入適量二氫吡啶標準工作液，然后加入到經過活化的HLB柱上，待自然流干后用純水淋洗，分別以10%—100%乙腈/水溶液洗脫并收集，將所得的洗脫液過有機濾膜后進UPLC-MS/MS分析，根據所得數據繪制洗脫曲線（圖3）。從圖3可以看出，二氫吡啶在HLB SPE柱上具有較好的保留，只有在乙腈的比例達到80%以上時才能獲得較為理想的回收率。因此，本研究選擇90%乙腈/水作為洗脫溶液，以盡可能減少雜質的共洗脫，從而降低基質效應對靈敏度的影響。

圖3 二氫吡啶在HLB柱上的洗脫曲線

3.4 基質效應

基質效應是LC-MS/MS聯用ESI接口最常見的問題，基質效應以離子抑制現象居多，離子增強則較為少見。樣品前處理難以把基質完全去除，因而在上機液中往往還存在大量的雜質，且其含量要遠大于目標化合物的量。在ESI電離時，這些雜質與目標化合物競爭電荷，使得目標物不能完全電離，甚至被基質所淹沒而完全沒有信號，導致提取液中目標物的響應值與標準溶液相比明顯降低，從而影響方法的定量。降低基質效應對定量結果影響的方法有內標法、標準添加法、基質添加法等[29-31]，其中標準添加法操作繁瑣，應用較少。通過比較二氫吡啶在UPLC-MS/MS上的相對響應值（基質添加標準溶液值/標準溶液值）可以看出，相對響應值約為80%左右，說明離子抑制現象的存在。由于缺乏商品化的氘代內標，本研究采用基質添加標準曲線來定量以彌補離子抑制造成的損失。

3.5 實際樣品測定

采用本方法對收集的18份飼料樣品（仔豬配合料2份、育肥豬配合料3份、魚配合料3份、豬濃縮料5份、牛精料補充料2份、羊精料補充料1份、添加劑預混料3份）進行了檢測，所有樣品中均未檢出二氫吡啶。為進一步驗證方法的準確性，對該18份飼料樣品進行了添加回收試驗，添加二氫吡啶的濃度均為100 μg·kg-1，檢測結果在87.5—99.8 μg·kg-1之間，平均回收率為92.6%。

4 結論

建立了超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）測定飼料中二氫吡啶的分析方法，該方法在0—500 μg·L-1濃度范圍內呈現良好的線性關系，二氫吡啶的檢出限為10 μg·kg-1，定量限為50 μg·kg-1，3個添加水平下的平均回收率為82.6%—101.0%，日內變異系數小于6.7%，日間變異系數小于9.2%。該方法操作簡便、快速、穩定，適用于飼料中二氫吡啶的測定。

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（責任編輯 林鑒非）

Quantitative Determination of Diludine in Animal Feeds by Ultra-performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

XIAO ZhiMing1, WANG Jun2, SUO DeCheng1, WEI ShuLin1, JIA Zheng1, LIU ChengXin1, FAN Xia1

(1China National Feed Quality Control Center, Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2Hubei Veterinary Drugs Inspection Department，Wuhan 430070)

【Objective】As a new kind of feed additive, diludine has been widely used in livestock production because it can promote the growth of animals, increase efficiency of the feed, and improve the meat quality. However, diludine is not allowed to use as a medical feed additive. The residues of diludine in animal origin foods may cause severe hypotensive reaction in the sensitive population. In the past World Consumer Rights Day, also known as 3.15, the national broadcaster China Central Television (CCTV) exposed parts of illegal use of veterinary drugs (e.g. diludine) in some of the feed companies, which draw extensive concerns of the society and the government. It is, therefore, of great importance to develop sensitive and reliable analytical methods to monitor diludine in feedstuffs in order to protect consumer rights and to provide technical support for government regulation.【Method】Chromatographic separation was achieved using a BEH C18column, and different mobile phases consisting of methanol-water, acetonitrile-water, methanol-0.1% formic acid, and acetonitrile-0.1% formic acid at different concentrations were optimized. In order to achieve the maximum sensitivity of ESI-MS/MS, direct infusion of standard solution was carried out in positive ionization mode to optimize the ESI source parameters (e.g. capillary voltage, cone voltage, and desolvation gas flow rate). Then dissociation with argon was induced and different collision energies and dwell times were compared in order to find the daughter ions, and the most abundant product ion was used as the quantification ion. In order to find the best sample preparation method, different extraction solvent (methanol and acetonitrile) and solid phase extraction (SPE) cartridges (C18, HLB, MCX and alumina B) were optimized. 【Result】The optimized sample preparation procedures were conditioned as follows: Feed samples were extracted using acetonitrile and the supernatants were evaporated to dryness under a gentle stream of nitrogen at 60℃. The residues were re-dissolved with acetonitrile/water (1:9), and then cleaned up on HLB SPE cartridges. The target compounds were identified and quantitatively determined by ultra-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization (ESI) tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) operated in multiple reaction monitoring mode (MRM). The molecular ion [M+H]+ of diludine is254, and the loss of –OCH2CH3(46 Da) is found to be common and leads to the major daughter ion208. The elimination of –CO (28 Da) from the ion208 gives the fragment at180, and then a subsequent loss of –COOCH2CH3(73 Da) leads to the fragment at108. Therefore, in this study, the quantitative ion was254＞208, while254＞180 was used for qualitative ion. Under the current optimized chromatographic conditions, each LC run was completed in 10 min. Good linearity was obtained in the ranges of 0-500 μg·L-1, with linear coefficients (R) higher than 0.9992. The limits of detection (LODs) and quantification (LOQs) which defined as the concentration with a signal-to-noise ratio (S/N) of 3 and 10, were 10 μg·kg-1and 50 μg·kg-1, respectively. Average recoveries from three fortification levels (10, 50 and 100 μg·kg-1) ranged between 82.6% and 101.0%, with relative standard deviations (RSD) lower than 9.2%. 【Conclusion】The proposed method is fast, sensitive, and easy to perform, making it applicable for high-throughput daily monitoring.

ultra-performance liquid chromatography; tandem mass spectrometry; animal feeds; diludine

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.017

2017-08-01；

2018-02-02

國家自然科學基金（31502116）、“十三五”國家重點研發計劃項目課題（2016YFF0201802）、中國農業科學院“飼料質量安全檢測與評價”創新團隊項目

肖志明，E-mail：xiaozhiming@caas.cn。

樊霞，E-mail：fanxia@caas.cn