雙波長HPLC法同時測定杜仲雄花中3種成分的含量

黃勤挽，王瑾，蘇娟，張玉莉，何劍（.成都中醫藥大學中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，成都市 637；.四川廣元億明生物科技有限公司，廣元市 6800）

杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.，常用藥用部位為樹皮和樹葉，具有補肝腎、強筋骨、安胎等功效，常用于肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈目眩、妊娠漏血、胎動不安的治療，是我國名貴的滋補藥材之一，其藥用歷史悠久，臨床應用廣泛[1，2]。

杜仲為落葉喬木，花單性，雌雄異株。雄花是杜仲雄樹開的花，以前僅用作傳粉授精，近年來被開發出新的利用途徑。現代研究表明，杜仲雄花含有同樹皮、樹葉類似的多種藥效物質成分[3]。本課題組采用雙波長高效液相色譜（HPLC）法同時測定杜仲雄花中京尼平苷酸、綠原酸、梔子苷3種成分的含量，以對其質量進行控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型HPLC儀，包括四元泵、DAD檢測器、柱溫箱、自動進樣器、色譜工作站（美國Agilent公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；SB2200超聲波發生器（中美合資上海必能信超聲有限公司）。

杜仲雄花（廣元億明生物科技有限公司提供，批號:20110401、20110402、20110403，產地:四川省旺蒼縣），經成都中醫藥大學標本中心盧先明教授鑒定為杜仲科植物杜仲E.ulmoides Oliv.的雄花；梔子苷（批號:110749-200613，供含量測定用）、綠原酸（批號:110753-200413，供含量測定用）對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供；京尼平苷酸標準品（供含量測定用，含量:99.3%）由成都瑞芬思生物科技有限公司提供；甲醇為色譜純，水為樂百氏純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備

取京尼平苷酸標準品與綠原酸、梔子苷對照品各適量，分別精密稱定，置同一量瓶中，加甲醇制成每1mL分別含0.0892、0.1052、0.1024mg的溶液，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取杜仲雄花粗粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率:180 W，頻率:40 kHz）60min，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補足減失的重量，濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱:Agilent Zorbax Extend C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相:甲醇-水-醋酸（15∶85∶1）；流速:1mL·min-1；檢測波長:238 nm（檢測京尼平苷酸和梔子苷）和327 nm（檢測綠原酸）；柱溫:30℃。理論板數按京尼平苷酸峰計算應不低于2000。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品（檢測波長238 nm）；B.混合對照品（檢測波長327 nm）；C.杜仲雄花（檢測波長238 nm）；D.杜仲雄花（檢測波長327 nm）；1.京尼平苷酸；2.綠原酸；3.梔子苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control（detection wavelength 238 nm）；B.mixed control（detection wavelength 327 nm）；C.male flowers of E.ulmoides（detection wavelength 238 nm）；D.male flowers of E.ulmoides（detection wave length 327 nm）；1.geniposidic acid；2.chlorogenic acid；3.geniposide

2.4 線性關系考察

精密吸取混合對照品溶液1、2、10、30、60μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定。以進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得京尼平苷酸、綠原酸、梔子苷的回歸方程分別為Y＝772.7X+100.9（r＝0.9995，n＝5）、Y＝1226X+71.71（r＝0.9995，n＝5）、Y＝1152X+93.96（r＝0.9995，n＝5）。結果表明，三者進樣量分別在0.0892～5.3520、0.1052～6.3120、0.1024～6.1440μg范圍內與各自峰面積積分值呈良好線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，連續進樣6次，記錄峰面積。結果，京尼平苷酸、綠原酸、梔子苷峰面積的RSD分別為1.08%、1.22%、1.25%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取杜仲雄花粗粉（批號:20110401）約0.5 g，共6份，分別精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述方法測定，計算3種成分的含量。結果，京尼平苷酸、綠原酸、梔子苷含量平均值的RSD分別為1.37%、1.55%、1.76%，表明方法重復性良好（n＝6）。

2.7 穩定性試驗

取杜仲雄花粗粉（批號:20110401）約0.5 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，于制備后0、1、2、4、8、12 h進樣測定，計算3種成分的含量。結果，京尼平苷酸、綠原酸、梔子苷含量平均值的RSD分別為1.24%、1.39%、1.41%（n＝6），表明杜仲雄花供試品溶液中京尼平苷酸、綠原酸、梔子苷在12 h內基本穩定。

2.8 加樣回收率試驗

稱取已測知含量的杜仲雄花粗粉（批號:20110401）6份，每份約0.25 g，分別加入上述3種對照品適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1～表3。

表1 京尼平苷酸的加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests of geniposidic acid（n＝6）

表2 綠原酸的加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Result of recovery tests of chlorogenic acid（n＝6）

表3 梔子苷的加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 3 Result of recovery tests of geniposide（n＝6）

2.9 樣品含量測定

取杜仲雄花樣品3批，每批平行3份，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定含量，結果見表4。

表4 杜仲雄花含量測定結果（%，n＝3）Tab 4 Results of content determination of male flower of E.ulmoides（%，n＝3）

3 討論

已見同時測定杜仲雄花中京尼平苷酸、綠原酸和梔子苷含量的文獻報道，但系采用單波長進行測定的方法，其中綠原酸未在其最大吸收峰處定量檢測[4]。本課題組采用DAD檢測器，設定的雙波長法能簡便、準確、快速地對杜仲雄花中3種成分的含量進行測定，結果滿意。在原有中藥單一成分質量控制模式下，普通的單波長檢測器能夠勝任，但隨著中藥質量控制要求的提高，進行中藥多成分質量控制模式是發展的必然趨勢[5]，需要VWD或DAD檢測器應用。除本文使用的雙波長全程直接檢測外，還可在分析過程中進行雙波長或多波長切換，即進行波長梯度檢測[6]。雙波長法或多波長法能方便、快速地對中藥中多種成分同時測定，能滿足中藥多成分質量控制的要求。

[1]張康健，王 藍，馬希漢.杜仲的綜合開發的進展與前景[J].西北林學院學報，1996，11（2）:75.

[2]冉懋雄，周厚瓊.對杜仲葉深度開發的思考與建議[J].中國藥房，1998，9（5）:203.

[3]董娟娥，梁宗鎖，張康健，等.杜仲雄花中次生代謝物合成積累的動態變化[J].植物資源與環境學報，2005，14（4）:7.

[4]李 欽，杜紅巖，杜蘭英，等.HPLC法測定杜仲雄花和杜仲雄花茶中京尼平苷酸、綠原酸和京尼平苷[J].中草藥，2009，40（1）:71.

[5]郝旭亮，張永文.中藥質量標準中建立多指標含量測定的必要性淺析[J].中國執業藥師，2009，9:31.

[6]田笑菲，李 清，梁 可，等.RP-HPLC雙波長切換法同時測定復方酸棗仁顆粒中芒果苷和斯皮諾素[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（11）:52.