Zeiss LSM710激光共聚焦掃描顯微鏡使用與管理的研究

王美軍，黃科，龔雨順，馬先鋒

[摘 要] 激光共聚焦掃描顯微鏡是一種領先的實驗手段，已經得到了廣泛的應用，因此掌握其操作使用方法和進行基本的維護十分重要。介紹了激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)硬件和軟件部分的構成；熒光樣品的制備及要求；樣品進行普通拍攝時光路、熒光檢測通道及圖像采集等參數(shù)的設置；最后在儀器的維護與管理上提出應保持室內整潔且溫濕度適宜，同時在操作使用上應按嚴格的操作規(guī)范進行。

[關 鍵 詞] Zeiss LSM710；激光共聚焦顯微鏡；操作使用；管理

[中圖分類號] TH742 [文獻標志碼] A [文章編號] 2096-0603（2018）07-0234-02

激光共聚焦掃描顯微鏡是一種現(xiàn)代化的光學顯微鏡，它在生物、醫(yī)學及工業(yè)等領域已有廣泛的應用。與普通光學顯微鏡不同的是，它以極細的激光束（點光源）替代傳統(tǒng)的汞燈或長效金屬鹵素燈（場光源）作為激發(fā)光，具有良好的匯聚性，且激光束激發(fā)的樣品區(qū)域大大縮小，減少了同一視野內相鄰樣品之間的發(fā)射信號干擾，其分辨力提高了30%～40%。此外，激光共聚焦掃描顯微鏡在檢測器前，焦平面的共軛位置加裝Pinhole。由于只有來自焦平面的發(fā)射光信號可以在共軛位置匯聚，穿過Pinhole，而來自非焦平面的發(fā)射光信號在共軛位置是發(fā)散的，絕大部分被Pinhole阻擋，所以檢測器只能接收來自焦平面的發(fā)射光信號。這樣，激光共聚焦掃描顯微鏡在很大程度上限制了來自非焦平面的信號干擾，大大增強了圖像的信噪比。

湖南農業(yè)大學園藝園林學院配置的是Zeiss LSM710倒置激光共聚焦顯鏡。文章以倒置共聚焦顯微為例，介紹了其硬軟件的構成，熒光樣品的制備要求、樣品拍攝的參數(shù)設置及儀器的維護與管理。

一、激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的組成

激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)由硬件和軟件部分組成，其中硬件部分為電動熒光顯微鏡、掃描檢測單元、激光器、電腦工作站，軟件部分為ZEN操作分析軟件。

（一）顯微鏡硬件部分

1.激光器。激光器覆蓋范圍較廣，能夠滿足多種熒光樣品成像需求，一般有四種，即近紫外Diode固體激光器405nm、藍激光Argon多線激光器458/488/514nm、綠激光He-Ne激光器543nm、紅激光He-Ne激光器633nm。

2.電動熒光顯微鏡。電動熒光顯微鏡分為正置顯微鏡和倒置顯微鏡，物鏡有低倍和高倍，低倍物鏡為5倍、10倍和20倍；高倍物鏡為40倍、63倍油鏡和100倍油鏡。

3.熒光掃描檢測器。檢測器檢測范圍為400～800nm，DIC通道1個，而光譜型熒光檢測器能在可見光范圍一次性全光譜掃描，其通道有34個。

4.電腦工作站。電腦工作站有Real Time PC 和User PC，Real Time PC是硬件與軟件間的連接器。

（二）顯微鏡軟件部分

激光共聚焦掃描顯微鏡軟件有ZEN2011軟件，ZEN軟件分為Zen2011 Black和Zen2011 Blue。電腦開機進入操作系統(tǒng)界面后，雙擊桌面共聚焦軟件ZEN圖標，進入ZEN界面，彈出對話框可選擇“Start System”和“Image Processing”。“Start System”為初始化整個系統(tǒng)，用于激光掃描取圖、分析等。“Image Processing”為不啟動共聚焦掃描硬件，用于已存圖像數(shù)據(jù)的處理、分析。

軟件的工具欄有不同的主頁面，分別為Locate、Acquisition、FCS、Processing和Maintain。Locate主頁面用于目鏡下觀察樣品，可以控制顯微鏡部分的電動元件，方便用戶完成樣品觀察。Acquisition主頁面用于圖像掃描，包含了掃描圖像所需的各種參數(shù)設置。FCS主頁面只在LSM 780和Confocor中出現(xiàn)，用于熒光相關光譜的檢測和分析。Processing主頁面包含了軟件提供的圖像處理工具。

Maintain主頁面提供了調節(jié)Pinhole位置，設置物鏡的工具，可以進行簡單的系統(tǒng)維護。

二、熒光樣品的制備

激光共聚焦顯微鏡需要對沒有自發(fā)熒光的生物樣品進行前處理，使其具有熒光標記，再進行檢測。獲得一份好的熒光標記的樣品是拍攝到一張好照片的先決條件，沒有好的樣品，即使有再高端的設備，再有經驗的技術員，也難以順利地觀察到樣品的熒光圖像。

（一）染料的選擇

傳統(tǒng)用于熒光標記的染料GFP、EGFP、YFP、DAPI、FM4-64、ECFP、ALexa-488、ALexa-546、ALexa-633等。DAPI和Alexa-405等染料可用405nm激光器觀察；GFP、EGFP、YFP、Alexa-488等熒光蛋白可用氬離子激光器觀察；RFP、Alexa-546和Cy3等染料可用543nm激光器觀察；Alexa-647和Cy5等染料可用633nm激光器觀察。

（二）熒光表達載體的構建與導入

通過分子生物學技術可進行熒光蛋白的構建，即通過PCR擴增目的蛋白的cDNA，接入熒光蛋白表達載體的多克隆位點。構建好的熒光表達載體進行大量擴增、純化、轉染并導入培養(yǎng)細胞。

（三）熒光樣品制備

熒光樣品制備是生物學研究的基本技術和方法，其制備需要一定的過程，制備的順序分為觀察、固定、脫水包埋、切片粘片、通透、封閉、一抗、二抗、復染和封片。固定在樣品制備中很重要，固定液的選擇應能最好地保持細胞和組織的形態(tài)結構，能最大限度地保存抗原的免疫活性，常用的固定液是4%的中性甲醛。對組織樣品來說，需脫水包埋，即用石蠟包埋，梯度脫水，如是冷凍切片可直接用OTC包埋。組織樣品的切片厚度應根據(jù)自己的材料特性決定，粘片時須平整。通透時可用乙醇和丙酮等試劑提高免疫染色效率，增強通透性。封閉可有效降低背景熒光信息，更好地觀察所需信號。一抗是整個免疫染色流程的核心，可通過做陽性對照，檢測一抗的特異性及摸索出合適的稀釋濃度。復染能夠確定細胞的位置和結構。最后的封片建議購買商品化的封片劑，蓋玻片的厚度和折光率需達標。

三、普通拍攝相關參數(shù)設置

（一）光路（channel）設置

對樣品的染料組合進行配置是激光共聚焦掃描顯微鏡成像的第一步。通過打開軟件選擇Start system，在目鏡下找到合適的視野和焦平面后，在Acquisition的smart setup中分別選擇染料類型和偽色完成染料的配置。掃描的方法有三種，即最快速掃描（Fastest）、最佳信號掃描（Best signal）和兼顧速度與信號的折中式掃描（Smartest）。如果激光波長不同，可以選擇Smartest（Line）模式，可將不同的染料放在不同通道里，減少或避免串色，同時可收集兩個通道的信號。

（二）熒光檢測通道的調節(jié)

光路設置的參數(shù)很多，每一個參數(shù)都關系到圖片成像的質量，因此需要對熒光檢測通道進行精細調節(jié)。

1.針孔（Pinhole）。針孔阻斷聚焦平面以外的信號進入，針孔直徑大小的設置很關鍵。針孔直徑越大，被收集到的熒光信號就越多，但收集到樣品的非焦面的雜射光也越多，同時樣品的成像厚度也隨之增厚，得到的信噪比反而不好。因此，在保證圖像質量的前提下，針孔一般設置為1AU，在最大程度上屏蔽非焦平面的信號。

2.激光強度。激光強度需設置在合理的范圍值，例如，激光488nm、514nm等，參考值在10～20范圍內。

3.激光管電壓（Gain Master）。激光管電壓用于調節(jié)圖像的亮度和對比度，數(shù)值越大，檢測PMT上所負荷的電壓越高，圖像信號越明亮。同時，隨著激光管電壓的增高，標本容易被漂白或淬滅。而且隨著激光管使用壽命的增加，激光的亮度會有所下降。因此，在保證圖像質量的前提下，電壓值越低越好，一般設置在600～800范圍內，最高不要超過850。

4.光電倍增管增益（Digital Gain）。對所有信號進行數(shù)碼放大，包括來自樣品的真實信號和環(huán)境背景噪音。電壓增大，信號和噪音會增強，電壓減小則信號和噪音均減小。原則上，在保證圖像質量的前提下，Gain值越小越好，一般設置為數(shù)值1.0～1.2。

5.數(shù)碼降噪和數(shù)碼增益（Digital Offset）。用以調節(jié)圖像背景，數(shù)值越小，背景越暗。原則上，Digital Offset值越接近0越好。

（三）圖像采集參數(shù)設置

在圖像獲取（Acquisition Mode）的參數(shù)設置中，圖像的分辨率（Frame Size）可設置為512×512或1024×1024；在掃描速度（speed）中，如是單張掃描可將速度設置為數(shù)字6或7；層掃或大圖拼接可設置為8；Averaging Number可設置為數(shù)字2或4。

在圖像預覽時，可使用Range Indicator檢查圖像是否過曝，如果出現(xiàn)紅色點表示過曝，一般一張圖片不允許紅色點的出現(xiàn)超過1%；出現(xiàn)藍色點表示曝光不足；白色點則表示正常。

四、激光共聚焦掃描顯微鏡的維護與管理

（一）保持室內整潔

激光共聚焦顯微鏡是極為精細的儀器，為保證良好的成像質量，對室內潔凈度要求較高。為保持室內的整潔，應定期對實驗室進行凈化和除塵，保持室內空氣潔凈；進入顯微鏡房的人員應穿著整潔的實驗服，更換專用的鞋套或拖鞋。同時應定期打掃實驗室，保證工作環(huán)境的潔凈。每次操作使用完后，應使用防塵罩遮蓋顯微鏡和掃描頭。

（二）室內溫濕度適宜

顯微鏡房溫濕度需控制在合適的范圍，通過安裝冷暖空調，保證室內溫度常年維持在22℃左右，如果需要做時間序列的實驗，在實驗期間溫度的變化不能超過0.5度/小時。濕度一般控制在40%～60%，當室內溫度在攝氏30℃時，相對濕度應低于65%。在南方地區(qū)，天氣比較潮濕，為了保護光學鏡頭避免霉變，建議用戶配置除濕機。北方用戶視要求需要加裝加濕器。

（三）操作使用規(guī)范

日常操作嚴格按照操作規(guī)程進行，遵守儀器的開關機流程。激光共聚焦掃描顯微鏡硬件的開機順序依次為打開穩(wěn)壓電源、主開關（Main Switch）、熒光顯微鏡和電腦電源（Systems/PC）、掃描頭和激光柜電源（Components）、熒光燈、激光器和電腦電源。在確保激光器充分散熱后關機應按著顛倒開機的順序依次關閉電腦、激光器等。

實驗前應準備好刻錄光盤，使用刻錄光驅刻錄圖像數(shù)據(jù)資料，嚴禁使用U盤拷貝資料。每次操作使用后需對物鏡、目鏡、聚光鏡以及載物臺面進行徹底清潔。

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