鹽析液液萃取—超高效液相色譜—串聯質譜法測定牛奶中的四環素類獸藥

摘 要：本文研究并建立了牛奶中四環素、土霉素、金霉素和強力霉素這4種四環素類獸藥的鹽析液-液微萃取-超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）的檢測方法。牛奶樣品經Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液提取，在硫酸銨輔助下采用乙腈萃取濃縮后，以0.1%（V/V）甲酸水溶液和乙腈為流動相梯度洗脫，經BEH C18柱分離，電噴霧正離子掃描，多反應監測模式（MRM）檢測，外標法進行定量。結果顯示，該方法下4種四環素類獸藥的最低檢出限為0.71μg/kg；4種化合物在1～100μg/kg濃度范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.999；在1、5、50μg/kg加標水平下回收率為81.71～109.06%，相對標準偏差均小于8%。本方法簡單快速、靈敏度高，經濟可靠，環境友好，適用于牛奶中四環素類獸藥的定性定量分析。

關鍵詞：鹽析液液萃取；超高效液相色譜-串聯質譜法；四環素類獸藥

目前，牛奶中四環素類獸藥的檢測方法主要有液相色譜-紫外檢測法、高效液相色譜-串聯質譜法和超高效液相色譜-串聯質譜法。樣品中四環素類獸藥的提取凈化方法主要有固相萃取法和液-液萃取法。近年來，在液-液萃取法的基礎上，又衍生出了鹽析液-液萃取法。這種方法是向樣品溶液和強極性有機溶劑組成的混合物中加入適當的鹽類化合物，促使有機溶劑更好地從混合物中分離出來[8]。該方法簡單、快速，在大大減少有機溶劑使用量的同時，能夠提高像四環素類獸藥這類極性化合物的萃取效率。

一、材料與方法

1.材料與試劑

鹽酸四環素（Tetracycline hydrochloride，97.7%）、鹽酸土霉素（Oxytetracycline hydrochloride，97.5%）、鹽酸金霉素（Chlortetracycline hydrochloride，93%）、鹽酸強力霉素（Doxycycline hyclate，98%），4種標準品購于Sigma公司。

乙腈、甲醇、甲酸，購于德國CNW公司，均為色譜純。

乙酸乙酯、乙腈、十二水合磷酸氫二鈉、一水合檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、硫酸銨、草酸銨均為分析純。

牛奶，由佛山市南海區水牛奶研究開發有限公司提供。

2.儀器與設備

Quattro Premier XE超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀（UPLC-MS/MS），美國Waters公司；OA-SYS水浴氮吹儀，美國Organomation公司；電子天平；旋渦混合器；超聲波清洗器；振蕩器；離心機。

3.實驗方法

（1）溶液配制

Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液：分別稱取2.10g檸檬酸和2.84g磷酸氫二鈉，用水溶解并定容至100mL；將100mL0.1mol/L檸檬酸溶液與62.5mL0.2mol/mL磷酸氫二鈉溶液混合，并加入6.05g乙二胺四乙酸二鈉，使其溶解，搖勻，必要時用氫氧化鈉或鹽酸調pH至4.0±0.05，即得0.1mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液。

標準溶液配制：分別精確稱取4種四環素類獸藥標準品2.5mg，用甲醇溶解并定容至25mL，配制成質量濃度為100μg/mL的標準儲備液，于-18℃下避光保存。根據需要用50%乙腈水溶液逐級稀釋，配制成合適濃度的混合標準工作液。

（2）樣品溶液的制備

稱取1g樣品置于50mL離心管中，添加5mL Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液，于旋渦混合器上充分混勻后，置于超聲波清洗器中超聲20min。然后，加入5mL乙腈，置于振蕩器上振蕩混勻15min。隨后，加入5g（NH4）2SO4，渦旋混勻后，4500rpm離心5min，上清液于50℃下N2吹干。殘渣用1mL50%乙腈水溶液溶解定容，過0.22μmPTFE濾膜，濾液供超高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

（3）UPLC-MS/MS檢測條件

UPLC條件：色譜柱：Acquity UPLC BEH C18，1.7 μm，100×2.1 mm；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL；流動相：A為0.1%的甲酸水溶液，B為色譜純乙腈；流速：0.2 mL/min；采用梯度洗脫。

質譜參數：電離方式：電噴霧正離子（ESI+）模式；毛細管電壓：2.5 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：300 ℃；脫溶劑氣流：N2，流速500 L/h；錐孔氣流：N2，流速50 L/h；碰撞氣：氬氣，流速0.12mL/min；掃描模式：多反應監測（MRM）。

二、結果與討論

1.質譜條件的優化

本實驗在調諧條件下通過注射器直接進樣，分別對1μg/mL的各個標準溶液進行母離子和子離子掃描，確定定量和定性離子對，對毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞能和駐留時間等參數進行了優化，表2列出了主要的優化參數。4種四環素類獸藥混標的總離子中可看出 4種獸藥在4min內即可實現快速分離檢測。

2.提取條件的優化

液-液萃取方法中，有機萃取溶劑的選擇至關重要。在日常的食品安全檢測中，常用的有機溶劑有甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮等。本文選取了乙腈和乙酸乙酯作為研究對象，按照1.3.2的方法處理樣品，通過目標化合物的平均回收率來評價兩者的萃取效果，結果見圖1。從圖中數據可見，采用乙腈作為萃取溶劑時，4種四環素類獸藥的平均回收率較高，說明相比于極性較弱的乙酸乙酯，具有強極性的乙腈萃取含有極性基團的四環素類獸藥的效果更好。而且，乙腈還具有沉淀蛋白質的能力，能夠提高凈化效果。

不同類型的銨鹽對液-液微萃取過程中相分離的程度存在一定的影響。銨鹽相比于其它鹽類，在電離室能夠輕易揮發或分解，從而避免對質譜造成損害，是一類質譜友好的鹽類化合物。本文研究了硫酸銨和草酸銨在液液萃取方法中對相分離程度的影響。從目標化合物的加標回收率實驗結果圖2可見，硫酸銨在液-液萃取過程中，能更好地促進乙腈和水相的分離，從而提高目標化合物的萃取效率，而且回收率的重現性也比草酸銨的要好。

根據國際純粹與應用化學聯合會（IUPAC）對檢出限的定義，本實驗在陰性牛奶中添加低濃度的混合標準溶液，使各標準品濃度水平分別為0.5μg/kg和1μg/kg，按1.3.2的方法處理，每個水平平行測定6次，計算標準偏差，以3倍標準偏差計算各個化合物的檢出限（置信水平P=95%），最終選取檢出限最低的化合物所對應的結果作為本方法的檢出限。結果顯示，這兩個水平的檢出限分別為0.71μg/kg和0.95μg/kg。然后，向陰性牛奶中添加0.71μg/kg的混合標準溶液，按照1.3.2中的方法驗證，結果顯示4種四環素類獸藥在超高效液相色譜-質譜聯用儀上仍然有響應，且信噪比S/N>3，因此，確定本方法的檢出限為0.71μg/kg。

三、結論

本文研究了鹽析液液萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法檢測牛奶中四環素、土霉素、金霉素和強力霉素這4種四環素類獸藥的檢測方法。該方法下4種四環素類獸藥最低檢出限為0.71μg/kg；4種化合物在1～100μg/kg質量濃度范圍內線性相關性較好，相關系數均大于0.999；在1、5、50μg/kg加標水平下平均回收率為81.71～109.06%，相對標準偏差均小于7%，滿足四環素類獸藥日常檢測工作的需要。本方法簡單快速、經濟可靠、靈敏度高、環境友好，適用于牛奶中四環素類獸藥的定性定量分析。

參考文獻：

[1]中華人民共和國農業部.中華人民共和國農業部公告第235號[EB/OL].2011-07-30

[2]GB/T 22990-2008牛奶和奶粉中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留量的測定液相色譜-紫外檢測法[S].北京：中國標準出版社，2008

[3]連英杰、吳敏、黎翠玉等.直接提取-超高壓液相色譜-電噴霧串聯質譜法檢測原料奶及奶制品中的四環素類抗生素[J].食品安全質量檢測學報，2013.4（2）：489-495

作者簡介：

羅瑞漣（1991--）女，碩士，主要從事食品風險檢測的工作。