黃曲霉毒素控制的突破

文開新

許多既有應用前景又令人興奮的技術正在不斷地被推出，它們能夠幫助人們應對作物的霉菌毒素污染問題，其中一個突破就是宿主誘導基因沉默技術。研究已證明了如何使用這項技術來減少收獲前玉米中的黃曲霉毒素。

中圖分類號：S852.4+4 文獻標志碼：C 文章編號：1001-0769（2018）05-0001-03

霉菌毒素是由各種真菌產生的有害于動物健康的化合物。據世界衛生組織（World Health Organization，WHO）估計，全球大約1/4的食物至少會被一種霉菌毒素污染。依據對農業生產損失和動物健康影響來說，問題最為嚴重的霉菌毒素是黃曲霉毒素。黃曲霉毒素由多種曲霉菌（Aspergillus Fungus）產生。由于其會影響動物健康，許多國家在法律上對人的黃曲霉毒素的攝入量都進行了規定，美國對食物中黃曲霉毒素含量的限定最為嚴格，要求不得超過20 μg/kg，而歐盟對嬰兒奶粉中黃曲霉毒素的含量要求不得高于0.025 μg/kg。

數十年來，對于如何降低食品/飼料中黃曲霉毒素含量的問題，商業界和學術界進行了多方面的研究。這些研究包括用不產霉菌毒素的曲霉菌來競爭天然產毒的曲霉菌、在易感作物中培育抗真菌或抗霉菌毒素的品種、使用螯合劑結合霉菌毒素來使其失去生物學活性。盡管人們做了很多努力，但是，據估計每年各類作物因黃曲霉毒素含量超標就要損失數百萬噸，這其中以玉米為主。

1 降低玉米中黃曲霉毒素的含量

玉米在全球范圍被大量用于食物/飼料，而且很容易被黃曲霉毒素污染。據估計全球每年約有50億人食用玉米，且主要集中在發展中國家，人們因食用受到霉菌毒素污染的玉米而導致霉菌毒素的長期攝入。然而，能夠降低生長期玉米籽粒中黃曲霉毒素水平的RNA干擾（RNA interference，RNAi）抑制技術已經得到成功應用。這種新方法利用了近期的兩項科學研究發現：一是所有的真核細胞都擁有基因抑制機制，包括一種被稱為Dicer的蛋白質，這種蛋白質使用“一個由小干擾RNA（Small Interfering RNA，siRNA）組成的模板分子”；另一個發現是這些siRNA分子能夠在植物宿主和污染病原體之間穿越；當帶有特殊序列的siRNA分子被引入病原體并在其中表達時，它會開始降解含有與引入siRNA同源序列的內源轉錄子；其結果是，通過引入專門設計的siRNA，病原體體內的靶基因表達表現為沉默或受到抑制。如果某一基因的RNA轉錄能夠通過這種方式被抑制，那么該轉錄就不能被翻譯成蛋白質。同時，由于蛋白質的缺失，相應的酶會失去活性；在本例中，該靶酶是毒素生物合成途徑的一個組成部分，因此病原體就不能產生毒素。如果需要沉默的基因位于表達病原體本身的siRNA中，那么該技術被稱作RNAi技術。該技術被證實是研究各種生物體基因功能的一項有用技術。如果該siRNA在某一生物體（如宿主細胞）中表達（本文指玉米細胞），而此靶基因在污染病原體體內會被抑制，RNAi抑制就超越了物種界限，這就是宿主誘導基因沉默（Host-Induced Gene Silencing，HIGS）技術。

2 靶向特定基因

在研究中，HIGS技術通過表達一種能夠在真菌黃曲霉毒素通路中靶向作用生物合成基因的RNAi盒來抑制被曲霉菌污染的玉米產生毒素。選擇通過RNAi技術來靶向抑制的基因為真菌聚酮合成酶基因（即aflC）。之所以選擇這個基因，是因為它編碼的一種蛋白質是生成全部四種黃曲霉毒素化合物的生物合成前體所必需的，因而抑制該酶的合成將導致曲霉菌不能產生毒素。另外，聚酮合成酶的編碼基因很大，因此選擇它作為抑制的目標，以提高在RNAi盒中使用該基因區域的可行性。RNAi盒只對曲霉菌基因有效，對宿主玉米或任何下游消費者（如人類、豬、牛等）表達的任何基因都不會表現出顯著的同源性。具體而言，所選擇的三個特定區域長度大約為200 bp，是真菌聚酮合成酶基因在可食用玉米籽粒部分中構建能夠表達RNAi抑制盒的區域。經生物信息學分析可知，所選曲霉菌aflC基因的三個區域與玉米、人、豬或牛的基因組沒有同源性。所選靶基因的三個區域將會被完全抑制，而不是僅僅縮短其長度，使編碼的酶仍保留一定的活性，或者是降低污染性黃曲霉菌產生耐藥性的概率，因為谷物的耐藥性可能由該病原體中aflC基因的三個正在突變的目標域組成。研究人員已經成功培育出轉基因玉米，同時分子分析顯示它能表達具有除草劑抗性的選擇性標記物Bar基因和插入式RNAiaflC基因盒。在RNAiaflC基因盒成功插入前，這種RNAiaflC表達水平最高的轉基因玉米采用自我授粉。研究人員種植了這種來自表達植物的玉米籽粒，但授粉10 d后玉米棒上仍生長出了一種可產生黃曲霉毒素的知名曲霉菌且數量相同。該感染在玉米籽粒的生長期持續保持30 d。在感染的最后，研究人員收集每個感染點周圍的玉米籽粒，并將每一株玉米的籽?；旌显谝黄鹨詸z測毒素的含量。每個玉米棒感染3～4次，每個感染點周圍有6～8顆籽粒。研究人員檢測了所有非轉基因對照玉米籽粒，測試結果為黃曲霉毒素含量介于1 000 μg/kg～220 000 μg/kg；然而，研究人員未能從轉基因玉米籽粒中檢測到毒素（圖1）。

隨后，研究人員使用定量反轉錄-聚合酶鏈式反應（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）方法測定從感染玉米組織中提取到的RNA，結果顯示，該目標aflC基因在與轉基因籽粒互作的真菌組織中都沒有表達，但在非轉基因玉米籽粒中有表達，而另一個用作表達對照的幾丁質合成酶在轉基因和非轉基因的受污染玉米籽粒中都有同等水平的表達。這些研究結果表明HIGS技術能用來減少生長期玉米籽粒中黃曲霉毒素的污染，從而能夠降低全球食物/飼料中的黃曲霉毒素水平。

3 探索計劃外的基因抑制

RNAi和HIGS技術在很大程度上依靠靶序列的特異性來抑制目標基因的表達。這種技術的一個潛在風險就是引入的siRNA分子可能不僅僅與靶基因具有序列同源性，甚至可能與其他所希望的目標基因也有同源性；就HIGS來說，其可能會與互作的生物體共用相似的基因而引起不必要的基因抑制。這種不必要的基因抑制通常會在生物技術群體中產生“計劃外的表現型”或“非靶向”表達。本研究向玉米籽粒中引入了siRNA分子，其目的是研究隨著RNAiaflC盒的引入是否會對內源性玉米RNA轉錄子產生任何不必要的抑制。試驗用的RNA提取自2個非轉基因對照玉米和3個表達RNAiaflC的轉基因玉米。所有RNA轉錄樣本通過一個新的兩兩比較法進行彼此間比較，尤其要注意轉基因玉米和非轉基因對照玉米的6組比較。盡管轉基因組和非轉基因組的每一兩兩比較能產生70～100個顯著轉錄差異，但是在對這6個轉基因和非轉基因玉米的兩兩比較時，研究人員發現與非轉基因對照組相比較，轉基因樣本中的任何一個轉錄均始終未見到始終如一的顯著差異。這說明當對兩個樣本（轉基因/非轉基因）進行比較時，由于玉米作物在自身的微環境和所處的生長階段上略微不同，它們在轉錄水平上還存在微小的差異。

然而，為了研究所引入的RNAi盒的表達在玉米籽粒中是否會出現轉錄上的差異，研究人員分析了6組兩兩對比，結果沒有在轉基因玉米籽粒中發現有持續不同的轉錄水平。如果所引入的RNAiaflC盒由于與玉米內源性基因具有同源性而引起非靶向表達，那么我們可以期待此RNA轉錄分析應該顯示。與2個非轉基因對照組相比，3個轉基因組的基因表達會被持續地抑制。這表明如果用來構建RNAi抑制盒的序列特異性地靶向作用于需抑制的基因，那么就不會發生非靶向或計劃外表型的事件。證明在RNAiaflC轉基因玉米籽粒和對照組玉米上的轉錄無顯著差異是朝著證明實質上等值的第一步，在本質上證明了該生物技術產品能在各個方面（引入的特性除外）與非轉基因對照相當，這是在生物技術特性邁向商業化時的一個調控手段。

該研究還表明，對于減少收獲前玉米中黃曲霉毒素的含量，HIGS技術是一項既有應用前景又令人興奮的手段；基于此，此項技術還可引入到其他對黃曲霉毒素敏感的作物，并可用于抑制其他真菌產生霉菌毒素。應用HIGS技術來抑制霉菌毒素合成路徑對提高人類健康以及增強全球食品安全性和穩定性來說是一個強大的工具。