登革病毒復制復合體的研究進展

羅娟　鄭素梅　高玉人

[摘 要]登革病毒的復制與宿主細胞膜的重建緊密相關。病毒和細胞因子產生獨特的類似細胞器的結構，被稱為病毒復制復合體（viral replication complex），這些病毒誘導的隔間促進了高效基因組復制，在病毒復制周期中得以使不同步驟受到精確的時空調控，并且保護病毒RNA不受宿主細胞質環境影響。綜合運用超微結構解析和功能研究大大增加了我們對病毒復制復合體構建和生物起源的理解。本文將介紹登革熱病毒復制復合體的形態和形成，闡述其在生物發生中所取得的進展。

[關鍵詞]登革病毒；正鏈RNA；復制復合體；內陷囊泡；膜重建；脂質

[中圖分類號]R373.33 [文獻標識碼]A

登革病毒（Dengue virus；DENV）屬于黃病毒科黃病毒屬，包括4個亞型：DENV1-4。它是一種蚊媒病毒，含單股正鏈RNA病毒，有包膜。每年大約有一億人感染DENV，感染者癥狀從輕微的感冒到危及生命的登革出血熱（dengue hemorrhagic fever）和登革休克綜合征（dengue shock syndrome）。登革熱廣泛流行于東南亞、非洲、美洲、地中海中部等地區，近50年來，其發病率呈逐年上升的趨勢。迄今為止，既無DENV預防疫苗問市，也沒有針對性的抗病毒治療方案應用于臨床。研究病毒基因組復制的分子機制有助于病毒疫苗以及具有特異性的抗病毒藥物的研發。

病毒依賴于宿主細胞代謝來擴增病毒基因組和組裝傳染性子代病毒。正鏈RNA病毒的復制發生在細胞質內或病毒誘導的類似細胞器的膜結構表面，這種膜結構可以被稱為病毒復制復合體，可以有效地促進病毒復制。首先，病毒復制復合體實現了RNA翻譯、復制和將病毒基因組組裝成病毒粒子，旦它們之間互不干擾；第二，病毒復制復合體可以使病毒復制酶復合物的組成成分和復制需要的代謝物在一個物理空間中保持高濃度；第三，為病毒RNA提供獨立于細胞質的環境是病毒復制復合體的另一個進化保守特征。在本綜述中，我們重點介紹病毒復制復合體的形態，詳細闡述病毒的膜重建，并討論這些病毒破壞細胞的膜活性蛋白和脂質穩態通路在病毒復制復合體生物形成中的最新發現。

1 復制復合體的結構

由于登革病毒的體積較小，約17-25nm，病毒學的研究一直與電子顯微鏡的發展密切相關。DENV誘導的復制復合體是內陷囊泡或球囊類型，是從內質網衍生出來的。利用電子斷層攝影技術對受DENV感染的人類肝癌細胞進行掃描，研究人員發現進入內質網腔內的是直徑大約90nm的單膜囊泡而非結構化復雜膜。這些囊泡通過大約10nm的孔樣通道與細胞質相連接。內陷囊泡中包含病毒復制酶和雙鏈RNA（double strand RNA；dsRNA），而結構化復雜膜不包含dsRNA，但它們富含病毒蛋白，可能在病毒蛋白的合成或儲存中發揮作用。Junjhon等在DENV感染的蚊子細胞中也觀察到內陷囊泡，卻沒有觀察到結構化復雜膜，這表明結構化復雜膜在登革復制周期中可能是一種對人細胞特異的結構。值得注意的是，DENV誘導產生的內陷囊泡與西尼羅河病毒（WNV）和蜱傳腦炎病毒（TBEV）誘導的復制復合體相類似，這表明黃病毒復制復合體在生物起源和結構進化上具有保守性。

2 復制周期的時空控制

不同生物合成步驟促進病毒復制周期的時空協調。病毒由受體介導進入易感靶細胞，由低PH介導病毒包膜與細胞膜融合，核衣殼釋放進入細胞質，脫殼后病毒RNA基因組轉運至內質網，作為信使RNA合成病毒蛋白。病毒 RNA5端的帽子結構介導帽子依賴性RNA翻譯。根據病毒多聚蛋白前體的共翻譯和翻譯后加工，膜結合的病毒因子和細胞因子以協調一致的方式誘導膜重排，形成病毒復制復合體。病毒的正鏈RNA被復制成負鏈RNA，負鏈RNA作為模板產生大量新的正鏈RNA，新的正鏈RNA又可以合成多聚蛋白或作為新負鏈RNA復制的模板或被組裝成病毒粒子。但是RNA翻譯與復制之間的轉換調節機制目前還不能確定。一種可能性是將核糖體排除在病毒RNA復制的位置，另一種可能性是病毒RNA基因組環化，使翻譯核糖體與病毒復制酶競爭性結合。RNA-RNA相互作用或蛋白質與病毒基因組末端的相互作用可以遠程介導上述復制與翻譯的拮抗作用。

3 復制復合體的病毒決定因素

病毒通過對膜脂質的局部改造或蛋白質的非對稱相互作用來構建利于其復制的膜系統。非結構蛋白NS4A和NS4B在DENV 誘導的膜重建中起著重要作用。兩者都有復雜的膜拓撲結構并包含中心螺旋，局部增加膜表面積，有利于誘導囊泡產生。這一過程可能是由NS4A的寡聚作用或NS4A與NS4B的相互作用維持的。但是，僅有NS4A或NS4B表達誘導產生的膜結構與DENV感染細胞所誘導的膜結構不同，說明還有額外的病毒蛋白參與了復制復合體的生成。研究發現NS1形成二聚體與膜結合并誘導膜重建，而且可能與NS4A-NS4B復合體相互作用。具有膜滲透活性的整合膜蛋白NS2A也可能參與了復制復合體的誘導，但具體機制還有待研究。除了蛋白質內在的膜活性，病毒還選擇性地影響脂質和膜穩態。這些過程包括招募細胞膜形成蛋白，刺激脂質體生成，并重組細胞脂質傳輸系統，具體調節病毒復制復合體膜成分。

4 膜活性蛋白對復制復合體形成的作用

關于病毒如何聯合選擇宿主細胞蛋白用于復制復合體形成的具體機制目前仍不明確。例如：中間纖維的結構組成部分波形蛋白與DENV非結構蛋白 NS4A相互作用。由NS4A介導的波形蛋白的招募依賴于病毒RNA的有效擴增。肌動蛋白絲的聚合在DENV誘導的膜重建中起著重要的作用（與內吞作用密切相關）。但是，膜重建中波形蛋白的作用與肌動蛋白絲的作用是否類似還有待研究。

波形蛋白對復制復合體的形成有重要作用，但是缺乏其他相關細胞因子的信息，目前我們只能從誘導同一類型的復制復合體的其他正鏈RNA病毒中推斷其作用。例如雀麥草花葉病毒（BMV），它也在內質網內腔的內陷囊泡中復制。這些囊泡的生成需要網狀蛋白。內質網蛋白包括類似發夾結構的跨膜區，與高曲率的內質網小管的產生和穩定有關。BMV復制酶蛋白1a（replicase protein 1a）將網狀蛋白招募到內質網膜的內陷部位，通過部分中和整體負膜曲率或穩定正膜曲率促進球形體積的擴增。網狀蛋白或其他細胞膜形成蛋白是否也參與了病毒復制復合體的生物形成，這個問題仍有待研究。

5 復制復合體形成對脂質生成的影響

除了重塑現有的細胞內膜，病毒復制復合體的生成意味著細胞內膜表面的凈增加，因此需要重新合成膜脂質。DENV感染細胞的高通量脂質分析顯示，病毒誘導的脂質成分發生的明顯變化包括主要脂質結構和信號脂類特異性的上調或下調。DENV不依賴由甾醇控制的調控元素結合蛋白（sterol regulatory element- binding protein；SREBP）介導的脂質生成，而是利用細胞內儲存的脂質。DENV感染會誘發自噬介導的脂滴分解，從而釋放游離脂肪酸。游離脂肪酸可用作建立病毒復制復合體的材料，或作為線粒體β氧化的能量來源。另外，DENV也會破壞脂肪酸合成酶（FAS）來刺激復制復合體的產生。FAS是一個大的含有多種酶活性的同質二聚體蛋白，用于脂質合成和細胞膜形成。非結構蛋白NS3與FAS相互作用，在復制復合體建立時招募FAS到病毒復制酶復合體上。NS3刺激FAS活性合成脂質，新合成的脂質與病毒RNA共同作用，表明在復制復合體形成過程中FAS直接參與膜的擴張。此外，西尼羅河病毒（WNV）也依賴于FAS，說明這種保守的功能在黃病毒復制復合體的生物形成中發揮了作用。

6 結論與展望

DENV基因組的復制與病毒復制復合體的形成有關，復制復合體的形成對病毒復制周期進行時空調控，確保RNA高效擴增以及必需的細胞因子保持一定的局部濃度，并保護病毒RNA不受細胞質環境影響。DENV誘導內陷囊泡或球囊類型的復制復合體，病毒內在膜蛋白的固有特性（膜活性區，不對稱的形狀和低聚性），有助于復制復合體的形成。DENV利用自噬從脂質中調集脂滴，同時利用脂肪酸合成酶來增加病毒誘導的細胞內膜表面積。

盡管先進的電子顯微鏡成像技術能在形態學細節上描述病毒復制復合體，但是它們的生物形成和共同選擇的細胞因子的復雜相互作用還尚待明確。由于技術上的局限，復制復合體形成的機制并不確定，特別是關于它們生物形成早期階段的信息是稀缺的。這些限制可以通過相關的光學和電子顯微鏡來克服，它們對細胞的分析具有極高的精確度。此外，病毒蛋白和RNA標記策略的技術應用于時間分辨成像，將為轉運加工過程和病毒復制周期中不同的時空調控提供更詳細的信息。病毒蛋白-固有膜相互作用的分子機制的描述也很少。在原生的膜環境中測定它們的三維結構，使用固態核磁共振波譜與膜模型體外研究相結合的策略將提供更深層次的解析。此外，病毒復制復合體的高通量蛋白質組學和脂質譜分析，將揭示它們的分子組成，從而擴大我們對與病毒復制復合體的生物發生和功能有關的宿主因素和途徑的認識。這些方法的綜合應用將揭示病毒誘導的膜結構，進一步揭示細胞膜內穩態的原理，為抗病毒治療提供新的途徑。

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