氨氮脅迫對虎紋蛙血液中部分生理生化指標的影響

黃艷 黎慧 李斌 劉盼 邵晨 王宇

摘要 [目的]探明氨氮脅迫對虎紋蛙（ Hoplobatrachus chinensis ）的毒性效應。[方法]采用96 h靜態毒性試驗法研究了不同濃度和不同暴露時間的氨氮對虎紋蛙血糖（Glu）、高鐵血紅蛋白（MetHb）、尿素氮（BUN）和血氨（BA）的影響。[結果]隨暴露時間的增加，Glu濃度出現顯著的先升后降，并在72 h后達到最大值；MetHb含量和BUN濃度則隨氨氮濃度的增加或者暴露時間的延長而增加；而BA則只在48～72 h的不同暴露時間下具有較大的變化。[結論]為降低氨氮對人工養殖虎紋蛙的影響，需要將養殖水體的氨氮濃度控制在59.46 mg/L以下。

關鍵詞 虎紋蛙；氨氮脅迫；血液生理生化指標

中圖分類號 S947.2文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）01-0087-04

Abstract [Objective] In order to understand the toxic effects of ammonia-N stress on blood physiological-biochemical indices of Hoplobatrachus chinensis .[Method] 96 h static toxicity tests in different concentrations and exposure time were used to evaluate the effects of ammonia-N on the concentration of blood glucose （Glu）， methemoglobin （MetHb）， blood urea nitrogen （BUN） and blood ammonia （BA）. [Result] With the exposure time increase， Glu concentration increased first and then decreased and it reached the maximum value at 72 h treatment；MetHb and BUN showed significant positive correlation with ammonia-N concentration or exposure time under the circumstance of the same exposure time or concentrations. Blood ammonia concentration changed significantly with exposing for 48-72 h. [Conclusion] It would be better to control the ammonia-N concentration under the safety level （59.46 mg/L） to reduce the effect of ammonia-N on breeding H.chinensis .

Key words Hoplobatrachus chinensis ；Ammonia-N stress；Blood biochemical indices

氨氮是養殖水體中最常見的污染物之一。在養殖過程中因投餌過多、養殖密度過大以及濫用殺菌劑和消毒劑等因素都會使水體中有機物含量增多，造成養殖水體氨氮的不斷累積，進而對養殖動物產生毒害作用[1-2]。已有研究顯示，氨氮脅迫將導致養殖動物的鰓、腎和肝臟等器官發生病變[3-4]，包括引起鰓部潰爛，鰓小片顯著增厚，腎小管退化，腎小囊出現膨脹、囊腔充血和阻塞以及肝臟組織充血、退化、壞死等癥狀[5-7]。此外，動物機體的呼吸系統、血液循環系統、排泄系統也會受到氨氮的影響，引起免疫力下降，并導致動物體病原菌易感性增強，最終影響其生長和存活[1，8-12]。然而，上述關于氨氮脅迫對水生動物毒性的研究目前主要集中在魚類和甲殼動物，對兩棲動物的毒性效應研究尚未見報道。兩棲動物是脊椎動物從水生過渡到陸生的重要類群，其生命活動的各個階段均離不開水環境。因此，以氨氮為代表的養殖水體污染可能是制約兩棲動物健康養殖的潛在重要因素。

虎紋蛙（ Hoplobatrachus chinensis ）是我國Ⅱ級保護野生動物，由于棲息地破壞及人類濫捕等因素導致其野生種群數量急劇下降。為滿足人類的消費需求，目前虎紋蛙已在海南、廣東、浙江等地開展了產業化養殖。該研究擬以虎紋蛙為研究對象，采用96 h靜態毒性實驗法，通過研究不同濃度和不同暴露時間氨氮對虎紋蛙血糖（Glu）、高鐵血紅蛋白（MetHb）、尿素氮（BUN）和血氨（BA）含量變化的影響，以期為探討虎紋蛙的人工健康養殖和氨氮對兩棲動物的毒害機制提供重要的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用虎紋蛙種群來自浙江省金華市某虎紋蛙養殖場。試驗前將體質健康、規格相近[體重（181.17±1.36） g，體長（12.58±0.12） cm]的虎紋蛙成體置于水族箱（90 cm×40 cm×40 cm）中馴養7 d，控制水溫為（22±1）℃，pH為7.0±0.1，溶氧量為（8.7±0.1）mg/L。每24 h用曝氣脫氯的自來水換水1次，并定時投喂虎紋蛙專用飼料（漳州市聯泰飼料有限公司）。

1.2 試驗設計

1.2.1 半致死濃度試驗。

在預試驗確定虎紋蛙24 h全部死亡和96 h全部存活的氨氮濃度后，在該濃度范圍內按照等對數梯度設計7個氨氮濃度組：220.00、293.37、391.22、521.70、695.70、927.73和1 237.15 mg/L，每個氨氮濃度設置2個平行組，同時設置空白對照組（0 mg/L）。氨氮溶液使用分析純NH4Cl配制，并采用納氏試劑法測定溶液的實際氨氮濃度，每24 h更換新配制的試驗溶液。試驗中觀察記錄不同濃度組在不同時間（24、48、72 和96 h）各個體的活動狀況、中毒癥狀和死亡個體數量，并及時去除死亡個體。

1.2.2 暴露試驗。

根據上述半致死濃度試驗結果，設置4個氨氮濃度組：0、120、360和600 mg/L，其中0 mg/L為對照組，其他濃度為處理組，每組2個平行（30只/每平行），試驗持續96 h。

1.3 血液樣品制備與檢測

暴露試驗期間，分別于0、24、48、72和96 h在每個濃度組中隨機采集6只虎紋蛙樣本于冰上毀髓斷頭取血。將血液置于含有EDTA抗凝劑的2 mL無菌離心管中，4 ℃靜置12 h，3 500 r/min離心15 min，取上清液于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。Glu、MetHb、BUN和BA的含量均使用南京建成生物工程研究所的相關試劑盒進行測定，測定方法和步驟參照試劑盒說明書。

1.4 數據處理

以氨氮濃度和暴露時間作為自變量進行雙因素方差分析（Two-Way ANOVA），若二因素間無顯著交互作用，則進行二因素的主效應分析；若二因素間有顯著交互作用，則固定其中1個因素的水平，對另一個因素進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。用LSD多重比較法進行組間差異顯著性檢驗。試驗數據以平均值 ± 標準誤（Mean±SE）表示，采用SPSS 21.0軟件包進行統計分析，顯著性水平取 α =0.05。氨氮對虎紋蛙的96 h半致死濃度采用直線內插法計算，以“96 h半致死濃度×0.1”作為其安全濃度。

2 結果與分析

2.1 氨氮對虎紋蛙的半致死濃度

半致死濃度（LC50）是受試生物對毒性物質的敏感性指標，其值越小，生物體對毒物越敏感，毒物對生物的毒性也越強[13]。試驗結果顯示，虎紋蛙從自然水體轉入不同濃度的氨氮水體均表現出不同程度的中毒癥狀，其死亡率隨著氨氮濃度的增加或暴露時間的延長而遞增，其累積死亡率見圖1。氨氮對虎紋蛙的96 h半致死濃度和安全濃度分別為594.62和59.46 mg/L。

2.2 氨氮對虎紋蛙血液中部分生理生化指標的影響

2.2.1 氨氮脅迫對虎紋蛙Glu的影響。

氨氮濃度和暴露時間雙因素對虎紋蛙Glu的影響無顯著交互作用（ P >0.05），氨氮濃度對Glu無顯著影響（ P >0.05）（表1）。主效應分析結果顯示，隨著暴露時間的延長，Glu先升后降。當暴露時間達到72 h時，Glu顯著高于其他暴露時間（圖2）。

2.2.2 氨氮脅迫對虎紋蛙MetHb的影響。

氨氮濃度和暴露時間雙因素對虎紋蛙MetHb的影響有顯著交互作用（ P <0.05），氨氮濃度和暴露時間均對MetHb有顯著影響（ P <0.05）（表1）。控制其中一個因素后所進行的單因素方差分析結果顯示：在相同氨氮濃度下，MetHb隨著暴露時間的延長而顯著增加；而相同時間內，MetHb隨著氨氮濃度的升高而顯著增加（圖3）。

2.2.3 氨氮脅迫對虎紋蛙BUN的影響。

氨氮濃度和暴露時間雙因素對虎紋蛙BUN的影響有顯著交互作用（ P <0.05），氨氮濃度和暴露時間均對BUN有顯著影響（ P <0.05）（表1）。單因素方差分析結果顯示，在同一氨氮濃度下，BUN隨著暴露時間的延長而緩慢增加，96 h時增加顯著；而在同一暴露時間下，隨著氨氮濃度的增加，BUN在24 h時并未升高，而在48、72和96 h時則顯著升高（圖4）。

2.2.4 氨氮脅迫對虎紋蛙BA的影響。

氨氮濃度和暴露時間雙因素對虎紋蛙BA的影響無顯著交互作用（ P >0.05）（表1）。結果分析顯示，BA在不同氨氮濃度下，暴露組均顯著高于對照組，但暴露組之間無顯著性差異（圖5）；在不同暴露時間下，BA 96和72 h均顯著高于24和48 h，但96和72 h之間、24和48 h之間均無顯著差異（圖6）。

3 結論與討論

氨氮在水體中主要以離子氨（NH+4）、分子氨（NH3）和銨鹽等形式存在，是普遍存在于水產養殖水體中的有害物質。不同水生動物對氨氮毒性的敏感性存在較大差異，具有不同的耐受性[14-16]。研究表明虎紋蛙對氨氮的96 h半致死濃度和安全濃度均遠高于虹鱒魚（ Oncorhynchus mykiss ）[14]、史氏鱘（ Acipenser schrencki ）[15]和克氏原螯蝦（ Procambarus clarkii ）[16]等魚類和甲殼動物，這可能與動物體自身的生理結構和生活習性有關。虎紋蛙屬于兩棲類，其生命活動雖然不能完全脫離水生環境，但其成體的主要呼吸器官肺對水體的依賴性要遠小于魚類和甲殼類的水體呼吸器管鰓，因此完全生活于水中的魚類和甲殼類動物的氨氮脅迫半致死濃度要遠大于半水棲的兩棲動物。

3.1 氨氮脅迫對虎紋蛙Glu的影響

動物的血液生理生化因子在正常情況下一般處于穩定狀態，但在外界環境因素的脅迫下，其動態平衡可能會遭到破壞，并進而導致正常生理功能的失衡。Glu作為動物體血液中的重要生化因子之一，其濃度的變化反映環境脅迫，如高密度放養、捕捉、裝載及運輸等的重要指標[17-19]。該研究中虎紋蛙的Glu在氨氮脅迫下隨暴露時間逐漸增加，并在72 h后達到最大值，隨后又在96 h后恢復脅迫前水平。說明在氨氮脅迫初期，虎紋蛙應對自身的能量分流和代謝調整產生了明顯的應激效應，引起動物體額外的能量需求，糖異生作用加強，從而導致Glu升高[20]。而隨著脅迫時間的延長，蛙體的應激效應通過自身調節得到緩解，Glu恢復正常水平。該結果與氨氮急性脅迫對青魚（ Mylopharyngodon piceus ）Glu影響的研究結果一致[21]，說明氨氮脅迫能夠對Glu產生顯著影響。此外，該結果也說明Glu在動物體內的變化具有時效性，僅能作為動物急性反應的重要指標。

3.2 氨氮脅迫對虎紋蛙MetHb的影響

MetHb是由血液中的血紅蛋白經氧化轉變而來。正常情況下，動物體內的MetHb含量極少，并處于不斷的生成與分解的動態平衡中。該研究虎紋蛙MetHb在氨氮脅迫下隨著暴露時間的延長或濃度的增加而顯著上升。表明在氨氮脅迫下，水體中的分子氨（NH3）因具有較高的脂溶性而極易穿透虎紋蛙的細胞膜進入體內，將血液中大量的血紅蛋白氧化為MetHb，降低血液的載氧能力[22]。觀察試驗發現，虎紋蛙的游泳和跳躍能力隨著氨氮脅迫時間的延長或濃度的增大出現明顯減弱的現象，這與對鯰魚運動能力[23]的研究結果相一致，說明氨氮脅迫可顯著增加MetHb在動物體內的含量，降低其體內的含氧量，進而影響水生動物的呼吸系統，引發一系列的生理反應，最終導致虎紋蛙的窒息和死亡。

3.3 氨氮脅迫對虎紋蛙BUN的影響

BUN是動物體蛋白質代謝的主要終末產物，可通過腎臟的過濾和重吸收作用而排出體外。然而，當腎臟發生病變時，腎小球的濾過率快速下降，BUN將不能通過腎臟隨尿液排出體外，導致血液中BUN的含量升高，引起代謝絮亂[24]。因此，動物體血液中BUN的含量可用于反映腎臟的健康狀況。該研究中虎紋蛙BUN在氨氮脅迫下具有明顯的時間和劑量雙效應，并與暴露時間的延長或濃度的升高呈正相關，結合相關研究推測氨氮脅迫可能對虎紋蛙的腎臟組織產生不同程度的損傷，如腎小管和動脈球的退化以及腎小囊的膨脹、阻塞、充血和出血等[6-7]。

3.4 氨氮脅迫對虎紋蛙BA的影響

BA是動物體內各種氨基酸經分解代謝產生的氨和腸管吸收的氨進入血液所形成的，通常會維持一個相對較低的含量。然而，在外源性氨源或肝臟發生病變等情況下，動物體內的BA含量會顯著上升。該研究虎紋蛙BA在氨氮脅迫下顯著增加，但不同濃度的氨氮對虎紋蛙BA的影響并無顯著差異；不同暴露時間對虎紋蛙BA變化的影響除48～72 h明顯外，其他時間均不顯著。該研究結果與氨氮脅迫對魚類BA的影響不同，并沒有出現BA隨著氨氮濃度增高和暴露時間的延長而呈顯著正相關[25]。推測這可能是虎紋蛙BA在外界氨氮刺激下達到一定閾值后，機體啟動自身調節機制來減少外源性氨氮的進入、增加體內氨氮的排泄以及生成谷氨酰胺和BUN等無毒物質，并將其貯存在各組織中，使機體內BA的積累量不再增加[26-28]，從而將BA穩定在一定的水平。

動物的血液生理生化指標可反映出該個體的健康狀態，該研究顯示氨氮脅迫對虎紋蛙血液中的Glu、MetHb、BUN和BA都具有一定影響。因此，控制虎紋蛙養殖水體中的氨氮濃度在安全范圍（< 59.46 mg/L）內將有助于該物種的健康安全養殖。

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