低濃度磷酸鹽對繡源河銅綠微囊藻和衣藻生長的影響

邱振魯 彭志蕓 陳鈺涵 李新顏 顏菲菲 曲奕　鐘曉璇

摘要 [目的]研究低濃度磷酸鹽對銅綠微囊藻和衣藻生長的影響。[方法]以BG-11培養基為基礎，配制成不同磷酸鹽質量濃度的培養基，使用葉綠素a含量與培養液吸光度作為指標檢測銅綠微囊藻和衣藻的生長狀況。[結果]磷酸鹽是銅綠微囊藻生長的限制性因素，其濃度為0.02～0.10 mg/L時，隨磷酸鹽濃度增加，銅綠微囊藻生長速率增高，在磷酸鹽質量濃度為0.10 mg/L時，生長情況最好；當濃度達到0.20 mg/L時，生長速率不再增高。而對于衣藻，磷酸鹽質量濃度0.01～0.15 mg/L可以促進衣藻的增殖，在質量濃度為0.10 mg/L時，其生長最好；而濃度達到0.20 mg/L時，衣藻的生長出現了輕微的抑制現象。[結論]該研究可為繡源河風景區水體富營養化的評價和預防提供可靠的數據參考。

關鍵詞 磷酸鹽；銅綠微囊藻；衣藻；葉綠素a；吸光度；繡源河

中圖分類號 S181 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）18-0054-03

Effect of Low Concentration of Phosphate on the Growth of Microcystis aeruginosa and Chlamydomonas reinhardtii in Xiuyuan River

QIU Zhenlu1，PENG Zhiyun2，CHEN Yuhan1 et al （1.College of Chemical and Biological Engineering，Qilu Institute of Technology，Jinan，Shandong 250200；2.College of Biological Science，Sichuan Agriculture University，Chengdu，Sichuan 611130）

Abstract [Objective]The research aimed to study the effect on the growth of Microcystis aeruginosa and Chlamydomonas reinhardtii under low concentrations of phosphate.[Method] The two alga were cultured in BG11 medium containing different concentrations of phosphate.And this article adopted the content of Chlorophyll a and absorbance of culture medium to indicate the growth of Microcystis aeruginosa and Chlamydomonas reinhardtii.[Result] Phosphate was the limiting factor for the growth of Microcystis aeruginosa.The growth rate of Microcystis aeruginosa increased with the concentration of phosphate increased from 0.02 mg/L to 0.10 mg/L.The optimum concentration of phosphate for the growth of Microcystis aeruginosa was proved to be 0.10 mg/L.But for Chlamydomonas reinhardtii，the growth was proliferated under the phosphate concentration ranged from 0.01 mg/L to 0.15 mg/L.The optimum concentration of phosphate for the growth of Chlamydomonas reinhardtii was proved to be 0.10 mg/L.The growth status was inhibited when the concentration reached 0.20 mg/L.[Conclusion]The study provides a reliable data reference for the evaluation and prevention of eutrophication in Xiuyuan River.

Key words Phosphate；Microcystis aeruginosa；Chlamydomonas reinhardtii；Chlorophyll a；Absorbance；Xiuyuan River

氮磷過多是造成水體富營養化的主要因素。銅綠微囊藻是藍藻水華中重要的藻類，氮和磷是影響其增殖的重要因素。研究表明，銅綠微囊藻對磷的濃度響應更為敏感[1-3]。關于磷對銅綠微囊藻生長的影響已見報道[4-6]。另有研究表明，銅綠微囊藻在磷營養缺乏的情況下仍能以較高生長速率維持生長數天左右，對水華形成具有重要的作用[7]。衣藻雖然不是水體富營養化的主要藻類，但也有相關衣藻水華的報道，如徐敏等[8]研究了武漢公園小池塘的衣藻水華消長的環境影響因素；朱詠莉等[9]對衣藻水華多次發生的原因進行了分析，其認為衣藻水華加速了水-泥界面磷素的釋放，造成部分沉降至底泥表面的藻體增殖和再懸浮。所以，在關注富營養化問題時也不能忽略衣藻的因素。對于小清河章丘段風景化改造的繡源河風景區水體，卻鮮見相關研究銅綠微囊藻和衣藻生長條件的報道。筆者對章丘繡源河風景區水體中分離得到的銅綠微囊藻和衣藻分別進行磷酸鹽生長影響的探索，在實驗室配置不同磷濃度的培養基，使用葉綠素a含量與培養液吸光度2個指標判定2種藻類的生長情況，并與其他水體中相同藻類的研究數據進行對比，以期為繡源河風景區水體富營養化程度的判定、預防和防治提供可靠的數據資料。

1 材料與方法

1.1 儀器 722型分光光度計（上海精密儀器儀表有限公司）、SW-CJ-2F超凈工作臺（上海一恒科學儀器有限公司）、YXQ-LS-75S立式壓力蒸汽滅菌鍋（山東鄄城光明儀器有限公司）、光照培養箱（北京永光明醫療儀器廠）、80-2型低速離心機（江蘇省金壇市正基儀器有限公司）、JY1002型電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1.2 培養基與試劑

每1 L培養基中含NaNO3 1.5 g、KNO3 0.04 g、Na2HPO4 0.04 g、MgSO4·7H2O 0.075 g、CaCl2·2H2O 0.036 g、C6H8O7 0.006 g、FeCl3·6H2O 0.006 g、EDTA-Na2 0.001 g、Na2CO3 0.002 g，微量元素A5 1 mL。

A5微量元素配方：每1 L中含有H3BO3 2.86 g、MnCl2·4H2O 1.86 g、ZnSO4·7H2O 0.22 g、NaMoO4·2H2O 0.39 g、CuSO4·5H2O 0.08 g。

1.3 磷酸鹽濃度梯度的配制 向培養基內加入Na2HPO4，使其最終濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L的濃度梯度培養基。

1.4 銅綠微囊藻和衣藻的分離培養

按照《全國湖泊富營養化調查規范》的要求對繡源河進行采樣，回實驗室后將水樣進行梯度稀釋并接種在提前配制好的24 h培養無雜菌、雜藻污染的BG-11培養基中，放入光照培養箱中，25 ℃，光暗比12 h∶12 h進行培養，至長出完整的藻落，將藻落在顯微鏡下進行觀察，選出銅綠微囊藻和衣藻，用毛細管吸取單細胞藻體分別接種在新的BG-11培養基中以獲得純種培養。

1.5 藻細胞的磷酸鹽饑餓培養及磷酸鹽生長影響試驗

將分離純化好的藻種接入BG-11液體培養基內進行擴大培養。將擴大培養后的藻液經過3 d饑餓處理，取20 mL藻液，4 000 r/min，離心10 min，離心后倒掉上清液，加入等體積的NaHCO3溶液（15 mg/L），充分振蕩搖勻后，再次離心倒去上清液，反復數次后，向沉淀中加入等量超純水，搖勻備用[10]。將處理后的藻液接入配制好的不同磷酸鹽質量濃度（0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L）的BG-11培養基中，接種量為20 mL。接種完畢，均在自然環境中培養，保證受光充分。pH不得高于8.5。經測定，培養液中的pH為8.0，符合培養條件。

1.6 藻體生長指標的測定

使用葉綠素a含量和培養液吸光度2個指標判定藻體生長狀況，從接種開始，每隔48 h測定一次這2個指標。吸光度的測定使用722型分光光度計，銅綠微囊藻測定在450 nm波長下，衣藻測定在470 nm波長下[10]進行。葉綠素a的測定使用甲醇萃取后在665 nm測定吸光度，依據公式

C=吸光度×13.9[11]計算葉綠素的含量（C）。

2 結果與分析

2.1 不同磷酸鹽濃度對銅綠微囊藻生長的影響

2.1.1 磷酸鹽濃度對葉綠素a含量的影響。

從圖1可看出，在不同磷酸鹽質量濃度下培養的藻液葉綠素a含量明顯不同，但變化周期和規律相對一致，增加速率最快發生在培養的第4～8天。磷酸鹽濃度0.01～0.15 mg/L的葉綠素a含量均比對照組高，且在0.02～0.10 mg/L隨磷酸鹽濃度增加，藻體內葉綠素a含量增大，說明此范圍內銅綠微囊藻葉綠素a的合成積累量與磷酸鹽濃度增加呈正相關，即此范圍內的磷酸鹽質量濃度顯著促進銅綠微囊藻的葉綠素a合成與生長繁殖，尤其在0.10 mg/L的濃度下，葉綠素a的增長最快，含量最高，說明此濃度是該培養條件下銅綠微囊藻生長的最適磷酸鹽質量濃度。當磷酸鹽濃度為0.15和0.20 mg/L時，葉綠素a含量與對照組差異不大，可認為此濃度的磷酸鹽對銅綠微囊藻的生長無明顯作用。

2.1.2 磷酸鹽濃度對銅綠微囊藻細胞吸光度的影響。

從圖2可看出，在不同磷酸鹽濃度下培養的藻液吸光度差異明顯，但變化規律與葉綠素a含量一樣，也呈現一致性。磷酸鹽濃度在0.01～0.15 mg/L時試驗組吸光度均高于對照組，且在0.02～0.10 mg/L時試驗組的吸光度明顯高于對照組，并隨磷酸鹽濃度增加，培養液吸光度增加，說明此范圍內銅綠微囊藻的生長與磷酸鹽濃度呈現正相關；另外，在磷酸鹽濃度為0.10 mg/L時，藻液的吸光度達到了增加最快，值也達到最大，說明此濃度是銅綠微囊藻的最適磷酸鹽濃度。磷酸鹽濃度為0.15和0.20 mg/L時，吸光度增加不明顯，與對照組差異不大，可認為0.15～0.20 mg/L磷酸鹽濃度對銅綠微囊藻的生長無影響。該指標所得數據與上述葉綠素a含量數據呈現一致性。

2.2 不同磷酸鹽濃度對衣藻生長的影響

2.2.1 磷酸鹽濃度對葉綠素a含量的影響。

從圖3可看出，不同磷酸鹽濃度下衣藻葉綠素a含量的變化從第6天才開始體現出來。磷酸鹽濃度在0～0.15 mg/L時，葉綠素a含量均比對照組高，表明此濃度范圍內均可以促進衣藻的生長繁殖。磷酸鹽濃度0.01～0.10 mg/L是與衣藻葉綠素a合成量呈正相關的濃度范圍，且在磷酸鹽濃度為0.10 mg/L時，葉綠素a的含量達到了最高。磷酸鹽濃度在0.20 mg/L時葉綠素a的含量比對照組有所降低，說明磷酸鹽濃度在0.20 mg/L時會抑制衣藻的葉綠素a合成。

2.2.2 磷酸鹽濃度對衣藻細胞吸光度的影響。

從圖4可看出，磷酸鹽濃度的差異對衣藻培養液的吸光度影響不如其對銅綠微囊藻明顯，并且在培養第8天后效果才逐漸顯現，磷酸鹽濃度在0～0.20 mg/L時吸光度較對照組均有所增加，且在磷酸鹽濃度為0.01～0.10 mg/L時，衣藻的吸光度增加最為明顯，說明此濃度范圍是衣藻生長的最適磷酸鹽濃度范圍。與葉綠素a指標比較，并沒有出現0.20 mg/L吸光度低于對照組的現象，可能是由于在此濃度下藻體細胞死亡仍然有吸光度但是不再合成葉綠素的原因，故認為0.20 mg/L磷酸鹽濃度也抑制了衣藻的生長。

3 討論與結論

該研究中磷酸鹽對銅綠微囊藻生長的影響與李夜光等[12]的研究數據基本一致，而與張勝花等[13]、張芹等[14]的研究差異較大，這可能是因為繡源河風景區水體中氮磷濃度一直較低，銅綠微囊藻吸收磷酸鹽的能力不強，利用磷酸鹽進行代謝的酶活性不高，所以試驗中所測得的最適磷濃度低于其他研究。銅綠微囊藻對于磷有較強的儲存能力，對營養鹽的結合也比其他藻類強，可以更有效地利用營養物質[14-15]，故后續試驗中還要進一步延長試驗周期，以檢測對蓄積磷的利用效果。另外，試驗中使用了靜置培養的方式，與其他研究中采用的搖床培養相比，不利于藻細胞與營養物質之間的充分混合，也可能是限制銅綠微囊藻利用磷酸鹽的因素。造成差異的具體機制后續會通過磷酸鹽蓄積試驗進行探究。

對于衣藻生長條件的研究所見報道較少，僅見李夜光等[12]的報道，與之相比該研究所測得的衣藻最適生長磷濃度相對較低的原因筆者認為可以同上述銅綠微囊藻的分析。

從繡源河風景區的監測數據來看，該區域水體并未達到富營養化的程度，但是由于其周邊不斷城鎮化的發展，由于山東大學即將遷址繡源河周邊，將來難免有更多的生活、試驗廢水排入繡源河水體，如果不加以嚴格控制，則水體的富營養化程度肯定會加強。所以對繡源河風景區水域進行富營養化的判定、預防和防治，目前都需要可靠的數據支持與相關技術的不斷進步。

參考文獻

[1]

SMITH V H.Low nitrogen to phosphorus ratios favor dominance by blue-green algae in lake phytoplankton[J].Science，1983，221（4611）：669-671.

[2] AHLGREN G.Phosphorus as growth-regulating factor relative to other environmental factors in cultured algae[J].Hydrobiologia 1988，170（1）：191-210.

[3] CHEN F，LI H B，WONG R N S，et al.Isolation and purification of the bioactive carotenoid zeaxanthin from the microalga Microcystis aeruginosa by highspeed countercurrent chromatography[J].Journal of chromatography A，2005，1064（2）：183-186.

[4] 岳冬梅，李潔，肖琳.營養鹽恢復對氮磷饑餓銅綠微囊藻生長的影響[J].環境科學，2016，37（11）：4220-4227.

[5] 安強，李雪琴，王沙，等.環境因子對三峽庫區銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）群體形成影響及其形態特征[J].湖泊科學，2017，29（2）：378-388.

[6] 張艷，馬放，李圭白.不同生長條件對銅綠微囊藻生長的影響[J].凈水技術，2014，33（3）：84-86，99

[7] 許海.河湖水體浮游植物群落生態特征與富營養化控制因子研究[D].南京：南京農業大學，2008.

[8] 徐敏，程凱，孟博，等.環境因子對衣藻水華消長影響的初步研究[J].華中師范大學學報（自然科學版），2001，35（3）：322-325.

[9] 朱詠莉，吳清，徐莎，等.衣藻增殖、懸浮與沉降過程對水-泥界面磷素動態的影響[J].南京林業大學學報（自然科學版），2014，38（6）：60-64.

[10] 王正方，張慶，盧勇，等.氮、磷、維生素和微量金屬對赤潮生物海洋原甲藻的增殖效應[J].東海海洋，1996，14（3）：33-38.

[11] 張鐵明.微量元素-鋅、鐵、錳對淡水浮游藻類增殖的影響[D].北京：首都師范大學，2006：74-80.

[12] 李夜光，李中奎，耿亞紅，等.富營養化水體中 N、P 濃度對浮游植物生長繁殖速率和生物量的影響[J].生態學報，2006，26（2）：317-325.

[13] 張勝花，葛芳杰，王紅強，等.不同氮磷營養條件下銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）對正磷酸鹽的蓄積效果[J].長江流域資源與環境，2008，17（6）：909-914.

[14] 張芹，李強，南紅巖.多因素綜合作用對銅綠微囊藻生長的影響[J].環境監測管理與技術，2017，29（5）：51-55.

[15] MAINSTONE C P，PARR W.Phosphorus in riversecology and management[J].Science of the total environment，2002，282/283：25-47.