尿黑酸影響擬南芥酪氨酸降解缺陷突變體sscd1的種子萌發

湯睿　雷雨婷　任春梅

摘要 [目的]探究外源添加尿黑酸對擬南芥酪氨酸降解途徑的影響。[方法]以擬南芥野生型和酪氨酸降解途徑缺陷突變體sscd1、hgo為材料，通過在培養基中添加不同濃度尿黑酸，分析長、短日照下對種子萌發的影響。[結果]在長、短日照下，外源添加0.1～0.4 mmol/L濃度尿黑酸推遲sscd1突變體種子萌發；外源添加0.8 mmol/L濃度尿黑酸抑制sscd1突變體種子萌發，而該濃度的尿黑酸對野生型和hgo突變體種子萌發沒有影響。另外，在培養基中添加酪氨酸降解途徑的異常代謝產物——琥珀酰丙酮，在長日照下也能抑制野生型種子萌發。[結論]尿黑酸處理后激活了酪氨酸降解途徑，使sscd1突變體中積累較多的琥珀酰丙酮從而影響其種子萌發。

關鍵詞 擬南芥；sscd1突變體；酪氨酸降解途徑；尿黑酸；琥珀酰丙酮；種子萌發

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）17-0092-04

Abstract [Objective]To investigate the effects of homogentisate on the tyrosine degradation pathway in Arabidopsis thaliana.[Method]Wildtype and tyrosine pathwaydeficient mutants （sscd1，hgo） of A. thaliana were used as materials to study the effects on seeds germination by adding different concentration of homogentisate under long or short day. [Result]The seeds germination of sscd1 mutant would be delayed by homogentisate with the concentration of 0.1-0.4 mmol/L under long or short day. The germination of sscd1 mutant was inhibited by 0.8 mmol/L homogentisate，while it had no effect on germination of wildtype and hgo mutant. In addition，succinylacetone，an abnormal metabolite of the tyrosine degradation pathway，also inhibited the germination of wildtype seeds under long day.[Conclusion]The tyrosine degradation pathway was activated with the treatment of homogentisate，thereby affecting the germination of the sscd1 mutant with succinylacetone accumulated.

Key words Arabidopsis thaliana；sscd1 mutant；Tyrosine degradation pathway；Homogentisate；Succinylacetone；Seed germination

對動物來說，酪氨酸降解是一條很重要的代謝途徑。在動物體內，酪氨酸先由酪氨酸氨基轉移酶催化生成對羥基苯丙酮酸，然后被對羥基苯丙酮酸雙氧化酶催化生成尿黑酸（homogentisate），再經尿黑酸1，2—雙加氧酶（homogentisate dioxygenase，HGO）作用氧化形成馬來酰乙酰乙酸（maleyl acetoacetate，MAA），后者經馬來酰乙酰乙酸異構酶作用形成延胡索酰乙酰乙酸（fumaroylacetoacetate，FAA），之后在延胡索酰乙酰乙酸酶（fumarylacetoacetate hydrolase，FAH）的作用下形成乙酰乙酸和延胡索酸進入三羧酸循環徹底分解[1-4]。

植物信號傳導實驗室前期通過EMS誘導法分離了一種在短日照條件下發生細胞死亡的擬南芥突變體sscd1[5]。這種突變體在短日照條件下的MS培養基上全部萌芽，培養一段時間后葉片會出現先萎蔫后白化的現象。采用臺盼藍染色的方法證實了突變體sscd1萎蔫處發生細胞死亡[6]。通過基因定位和序列分析發現sscd1基因編碼酪氨酸降解途徑的最后一個酶FAH。酪氨酸降解途徑在動物中是必不可少的，FAH缺失會導致動物先天性致死。FAH基因發生突變將導致中間代謝產物MAA、FAA的積累，一旦MAA和FAA在體內積累將會引起異常代謝，并轉化為琥珀酰乙酰乙酸（succinylacetoacetate，SAA），并且SAA進一步自發經過非酶促的脫羧反應形成琥珀酰丙酮（succinylacetone，SUAC）[7]。前期研究發現，在植物中，SUAC在短日照下才出現積累，長日照下則不會[8]。然而，酪氨酸降解途徑在植物中的作用仍有待闡明。該試驗以擬南芥野生型Col-0和酪氨酸降解途徑缺陷突變體sscd1、hgo為研究材料，通過外源添加尿黑酸處理的方法來研究長、短日照下Col-0、sscd1和hgo萌發的變化。探究尿黑酸對擬南芥酪氨酸降解途徑的影響，并對尿黑酸在植物體內的作用做進一步了解。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Columbia（Col-0，WT）、酪氨酸降解缺陷突變體sscd1和hgo，全部由植物信號傳導實驗室提供。

1.2 試劑與儀器

尿黑酸（東京化成工業株式會社D1050，1 g，日本）；MS培養基粉（Phyto technology laboratories M519，100 L，美國）；SYBR（Roche 04913914001，100 mL，瑞士）；蔗糖；瓊脂粉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；智能人工氣候箱（PRX-450B，賽福）。

1.3 方法

1.3.1 尿黑酸、琥珀酰丙酮母液配制及添加。

稱取0.336 g尿黑酸溶于20 mL 30%丙酮溶液中，配制成100 mmol/L母液，抽濾滅菌，置于-20 ℃避光保存。使用時取不同體積尿黑酸母液加入MS培養基中混勻，配制成含不同濃度尿黑酸的MS培養基。

稱取0.024 g琥珀酰丙酮溶于100 μL丙酮配制成100 μg/mL母液。使用時取不同體積琥珀酰丙酮母液加入MS培養基中混勻，配制成含不同濃度琥珀酰丙酮的MS培養基。

1.3.2 擬南芥的培養。

1.3.2.1 尿黑酸處理培養。擬南芥種子用消毒液（20%bleach+0.1%Triton 100）處理10～12 min，隨后置于超凈工作臺上將消毒水去除并用無菌水清洗種子3～4次后懸浮于0.1%瓊脂溶液中，鋪種在含1%蔗糖和不含或分別含有0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L尿黑酸的MS培養基上，放置4 ℃冰箱春化3 d，再置于光周期為長日照（long day，16 h光照，8 h黑暗）和短日照（short day，8 h光照，16 h黑暗）的人工氣候箱生長，培養溫度設置為（22±2）℃，光照強度設置為80～120 lx，相對濕度設置為65%。

1.3.2.2 琥珀酰丙酮處理培養。擬南芥種子用消毒液（20%bleach+0.1%Triton 100）處理10～12 min，隨后置于超凈工作臺上將消毒水去除并用無菌水清洗種子3～4次后懸浮于0.1%瓊脂溶液中，鋪種在含1%蔗糖和不含或分別含有60、120、240 μg/mL琥珀酰丙酮（SUAC）的MS培養基上，放置4 ℃下春化3 d，再置于光周期為8 h光照和16 h黑暗的人工氣候箱生長，培養溫度設置為（22±2）℃，光照強度設置為80～120 lx，相對濕度設置為65%。

1.4 測定方法及指標

選取長、短日照條件下尿黑酸處理的擬南芥材料，分別對野生型、hgo和sscd1突變體材料的萌發情況進行統計。尿黑酸處理后的種子萌發率/未處理野生型的種子萌發率即為種子的相對萌發率，選取經SUAC處理的野生型和sscd1突變體材料，分別對2種材料的萌發情況進行統計，SUAC處理后萌發的種子數/鋪種的全部種子數即為種子的萌發率，結果為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 尿黑酸處理影響sscd1突變體的種子萌發

為了進一步研究外源添加尿黑酸對酪氨酸降解途徑的影響，對長、短日照條件下生長1、2 d的種子相對萌發率進行統計發現（圖1），長日照下生長1 d，野生型、hgo和sscd1突變體在不含尿黑酸情況下相對萌發率差別不大；外源添加尿黑酸對野生型和hgo突變體的相對萌發率也無明顯影響，而sscd1突變體的相對萌發率隨著尿黑酸濃度的增加顯著降低，在0～0.8 mmol/L范圍內相對萌發率分別為100%、75.5%、67.2%、59.7%和27.0%（圖1A）。短日照萌發情況與長日照類似，外源添加尿黑酸對野生型和hgo突變體的相對萌發率影響不大，sscd1突變體的相對萌發率同樣隨著尿黑酸濃度增加而逐漸降低（圖1B）。無論長日照還是短日照，生長2 d時，sscd1突變體相對萌發率都有明顯上升（圖1C、1D）。

長、短日照1 d，尿黑酸對sscd1突變體萌發有明顯抑制作用，其中長日照對萌發的抑制效果比短日照更明顯（圖1A、1B）。生長2 d，尿黑酸對sscd1突變體萌發的抑制作用明顯減弱：在0～0.4 mmol/L濃度范圍內，對sscd1突變體萌發抑制減弱，甚至在0.1、0.2 mmol/L 濃度下相對萌發率恢復到與野生型和hgo突變體一致；濃度為0.4 mmol/L時仍存在抑制作用，但是短日照比長日照抑制更明顯；當濃度增加至0.8 mmol/L后，長、短日照下萌發率基本一致（圖1C、1D）。生長2 d，未萌發種子不再萌發，長、短日照培養5 d后，野生型和hgo突變體基本萌發，而sscd1突變體有大部分未萌發（圖2）。這表明低濃度尿黑酸延遲擬南芥種子萌發，高濃度

2.2 琥珀酰丙酮（SUAC）處理影響野生型擬南芥的種子萌發

前期研究發現sscd1突變體在短日照下積累SUAC，該物質是FAH功能失活后酪氨酸降解異常產生的代謝產物。為了探究作為中間代謝產物的SUAC對擬南芥種子萌發的影響，對長日照條件下SUAC處理的種子萌發率進行統計后發現（圖3）：未添加SUAC生長1 d（LD-1）時萌發率最高為85.5%；添加60 μg/mL SUAC后萌發率為71.0%；添加120 μg/mL SUAC后萌發率為68.5%；添加240 μg/mL SUAC后萌發率為57.5%。生長3 d時，不同濃度SUAC處理的野生型材料萌發率都呈現上升趨勢，不含或分別含有60、120和240 μg/mL SUAC的萌發率分別為100%、80.5%、75.0%、65.0%。繼續長日照培養8 d后發現，不含SUAC處理的培養基中，野生型正常生長（圖4A）；SUAC含量達60、120 μg/mL時，種子萌發和幼苗生長都開始受到抑制（圖4B、4C），且SUAC含量達120 μg/mL后，幼苗葉片開始出現白化死亡表型（圖4C）；隨著SUAC含量的繼續上升，種子萌發和幼苗生長受到強烈抑制（圖4D）。這表明，添加SUAC處理抑制了野生型種子的萌發，且隨著濃度升高抑制明顯，未接受處理則不受影響。

3 討論

尿黑酸作為酪氨酸降解途徑的一個重要中間代謝產物，它對酪氨酸降解途徑正常代謝起著至關重要的作用。前期研究發現，引起死亡的原因是酪氨酸降解途徑的中斷，導致中間代謝產物MAA和FAA的積累，這些代謝產物將會毒害動物的細胞和組織，最終引起動物死亡[9-10]。當FAH基因失活，將導致中間代謝產物MAA、FAA的積累，并引起代謝異常，MAA和FAA轉化為SAA，接著SAA經過自發的非酶促脫羧反應形成SUAC[7]。SUAC對生物細胞有毒害作用，SUAC在體內積累會導致細胞死亡[11]。編碼酪氨酸降解途徑第三步酶HGO的基因發生突變后能阻斷中間代謝產物MAA和SAA的產生，所以在hgo突變體中不會產生SUAC。通過外源添加SUAC試驗，發現一定濃度SUAC能夠加速sscd1突變體細胞死亡，而這種細胞死亡是因為中間代謝產物SUAC積累所引起[8]。在該研究中，長、短日照條件下sscd1突變體的種子萌發均受到了明顯抑制，說明添加尿黑酸促進了酪氨酸降解，使sscd1突變體中酪氨酸降解途徑異常代謝產物SUAC的積累增多，從而抑制種子萌發。一定濃度的尿黑酸處理野生型和hgo突變體，對幼苗萌發沒有明顯的影響，這是因為在野生型中酪氨酸降解途徑是完整的，它自身能夠對一定量多余的中間代謝產物進行代謝；而在hgo突變體中，HGO的缺失雖然不能將尿黑酸通過酪氨酸降解途徑分解代謝，但尿黑酸可能走其他的代謝途徑，比如維生素E合成途徑[12]。長、短日照下添加0.1～0.4 mmol/L尿黑酸對sscd1突變體種子萌發有延緩作用，而添加0.8 mmol/L尿黑酸對sscd1突變體種子萌發有抑制作用。這是因為外源添加尿黑酸，促進了酪氨酸代謝途徑的中間代謝產物積累（MAA、FAA、SAA和SUAC），未萌發時不能代謝過量的中間代謝產物，從而抑制了種子萌發；由于尿黑酸本身就具有一定的毒性，在動物體中如果尿黑酸過量，嚴重時會患上尿黑癥[13]。在培養時也發現了類似情況，當外源添加尿黑酸濃度過高時，擬南芥種皮顏色會變為黑褐色，且sscd1突變體幼苗子葉也會褐化。這一結果與外源添加SUAC結果一致[8]。為了驗證以上結果，進行了外源添加SUAC試驗。擬南芥野生型體內酪氨酸降解途徑是正常的，外源添加SUAC后，發現添加SUAC抑制了種子萌發，隨著濃度的增加，抑制作用越強。說明SUAC能夠抑制種子萌發，在酪氨酸降解途徑正常情況下，植物自身能夠代謝少量的SUAC，從而在培養幾天后種子萌發能得到恢復，但超過植物自身代謝量后，會造成毒害作用且抑制種子萌發和細胞發生死亡。該結果也進一步證明了酪氨酸降解途徑異常代謝產物SUAC的積累過多，抑制了sscd1突變體種子的萌發。

4 結論

利用生理分析的方法，發現尿黑酸處理能激活酪氨酸降

解途徑，加速植物體內酪氨酸降解途徑，使sscd1突變體中

SUAC的積累增多，從而抑制sscd1突變體種子的萌發。

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