木霉菌油懸浮劑組合施藥對獼猴桃細菌性潰瘍病的防治效果

葉乃瑋 王承芳 耿稞 張信旺 毛偉力

摘要 [目的]探討木霉菌油懸浮劑組合施藥防治獼猴桃細菌性潰瘍病的效果。[方法]通過液體發酵和劑型處理，將木霉（Trichoderma spp.）菌株Tr309T制成含2×108個/g或 2×108個/mL 分生孢子的可濕性粉劑（WP）或油懸浮劑（SC），于2016和2017年在上海卉綠農場進行單項施藥（灌根、噴霧、涂抹）和組合施藥[噴霧+涂抹（A）或灌根+噴霧+涂抹（B）]對比試驗，測定它們對獼猴桃細菌性潰瘍病的防治效果。[結果]經Tr309T-WP、Tr309T-SC所進行的單項施藥處理的病情指數、防治效果和病斑治愈率，均分別顯著高于或低于化學藥劑處理；而經Tr309T-SC或2%潰腐靈SC的組合施藥方式A或B處理的獼猴桃植株的病情指數和防治效果均分別顯著低于或高于Tr309T-WP和病原對照組合施藥處理。[結論]該研究結果為獼猴桃細菌性潰瘍病的生物防治提供了理論依據。

關鍵詞 獼猴桃潰瘍??；油懸浮劑；木霉菌；組合施藥

中圖分類號 S436.634.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）17-0161-04

Abstract [Objective] The aim was to explore the control effect of combined application methods of an oilbased suspension with Trichoderma spp. on bacterial canker of kiwi. [Method] By the processes of liquid fermentation and formulation， a wettable powder （WP） and an oilbased suspension （SC） formulations containing 2×108 individuals/g or 2×108 individuals/mL conidial spores of Trichoderma spp. strain Tr309T were made and used to conduct individual application tests of root drench， spraying and coating or in a combination of spraying + coating （A） or root drench + spraying + coating （B） on controlling the disease of bacterial canker of kiwi. [Result] The disease severity and efficacy rate of disease control in the treatments of root drench， spraying or coating with Tr309TWP or Tr309TSC were all significantly higher or lower， respectively， than those with the treatment of 2% atractylodin + magnolol SC. On the other hand， the disease severity and efficacy rate of disease control in the treatments with combined application of A or B with Tr309TSC or the treatment of 2% atractylodin + magnolol SC were significantly lower or higher， respectively， than those with the treatments of Tr309TWP and pathogen control. [Conclusion] The results provide reference for the biological control of bacterial canker of kiwi.

Key words Bacterial canker of kiwi；Oilbased suspension formulation；Trichoderma spp.；Combined application

獼猴桃細菌性潰瘍病是一種由丁香假單胞桿菌-獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv.actinidiae，PSA）侵染，并嚴重威脅獼猴桃生產和發展的毀滅性病害。該病害具有致病性強、傳播快、發生范圍廣、防治難度大等特點，在短期內可造成大面積樹體死亡，已被國家列為中國森林植物檢疫性病害[1]。1980年該病首次在美國加利福尼亞州和日本的神州靜岡縣發現[2]。方炎祖等[3] 于1985年在湖南省東山峰農場的獼猴桃果園中首次發現了該病，當年的發病面積就從一個點擴展到13 hm2。該病菌主要通過風、雨、昆蟲、農具等媒介進行傳播。雨水充足易使PSA菌量增加，降水量與病害的流行程度有顯著相關性[4-5]。

目前，生產上對獼猴桃潰瘍病的防治主要通過農田管理和化學農藥。李泉廠等[6]研究表明，使用72%農用鏈霉素和46%可殺得，對發病初期的獼猴桃植株有一定的防治作用，但對進入發病盛期植株的防治效果不明顯。由于病原菌對多種化學農藥的抗藥性日益加重，導致農用鏈霉素對該病害的防治效果愈來愈差。目前市面上還未出現一種能有效防治獼猴桃潰瘍病的化學藥劑[7]。馮華等[8]研究指出，通過高效、低毒農藥的交替使用，配合多元組合施藥方式，可提高防治效果。高蓬明等[9]采用噴霧+涂抹+刮除病斑相結合方法，用72%硫酸鏈霉素等20種殺菌劑對獼猴桃潰瘍病進行室內生測和田間試驗，為有效防治獼猴桃潰瘍病提供了依據。張鋒等[10]采用枝干注射、噴霧、涂抹、灌根等不同組合施藥方法進行試驗，結果顯示，噴霧+刮除病斑+涂抹組合的防治效果可達96%。

近年來，許多科研人員嘗試用生防菌對獼猴桃潰瘍病進行防治[11-12]。邵寶林等[13]在獼猴桃根部分離得到一株芽孢桿菌B2，用稀釋50倍的發酵液噴霧，對該病的防效可達86.52%。盛存波等[12]用芽孢桿菌B56-3的100倍發酵稀釋液噴霧，對潰瘍病的防效在86.5%～91.4%。申哲等[14]利用放線菌gCLA4的發酵液粗提物稀釋100倍對獼猴桃潰瘍病的防效達64.9%。謝俊等[15]在開發防治獼猴桃潰瘍病的木霉菌生物農藥劑型時發現，與可濕性粉劑相比，油懸浮劑具有滲透性和黏附性強、抗蒸發、耐雨水沖刷、增效等優點。筆者利用2種木霉菌制劑，對獼猴桃潰瘍病進行大田組合施藥防治試驗，旨在為生物防治獼猴桃潰瘍病，特別在劑型和使用方法的選擇上提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 木霉菌株。Tr14（T.asperellum）、Tr25（T.koningiopsis）、Tr34（T.virens）、Tr309T（T.viride）、Tr121（T.harzianum）、Tr64（T.atroviride）均由上海萬力華生物科技有限公司提供。

1.1.2 病原菌。Pseudomonas syringae pv.actinidiae（PSA）和獼猴桃樹苗（紅陽）均由佳沃（成都）現代農業有限公司提供。

1.1.3 培養基。營養肉湯培養基（NB）；

馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL。

1.1.4 供試藥劑。

Tr309T-WP和Tr309T-SC均為上海萬力華生物科技有限公司產品；

2%潰腐靈SC為濰坊奧豐作物病毒防治有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌株與病原菌（PSA）平板拮抗篩選試驗。

1.2.1.1 木霉菌株分生孢子液的制備。用無菌接種鏟刮取在PDA平板上培養了5 d（28 ℃）的各木霉菌株的分生孢子并轉至含10 mL無菌水的試管中，用血球計數板計數后，用無菌水將分生孢子稀釋至2×108個/mL備用。

1.2.1.2 PSA菌液的制備。用接種針將保存于試管斜面上的PSA在無菌條件下接種至裝有100 mL NB培養基的500 mL三角瓶中，置于18 ℃、180 r/min搖床上培養48 h。吸取1 mL PSA菌液至裝有9 mL無菌水的試管中，用Petrroff-Hauser計菌板計數，用無菌水將PSA菌液含菌量稀釋至2×109個/mL備用。

1.2.1.3 木霉菌分生孢子與PSA混合菌液的制備。用移液槍分別吸取木霉菌分生孢子液（2×108 個/mL）和PSA菌液（2×109個/mL）各0.5 mL，加入含9 mL無菌水的試管中，在振蕩器上搖勻后，取1 mL菌液，按梯度稀釋至 1×10-8個/mL；分別從1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8個/mL梯度試管中各取0.2 mL菌液至PDA平板上，均勻涂布，每組3個重復。以單個病原菌和木霉菌株作為空白對照。在18 ℃下培養5 d后，分別進行觀察和統計。

1.2.2 田間藥效試驗。

1.2.2.1 施藥方法。

試驗地點為上海浦東孫橋卉綠農場，獼猴桃（紅陽）樹齡為2～3年。

施藥方法：①噴霧施藥。均勻噴霧在葉片正反面及枝干上，間隔7 d施藥1次，共施藥3次，用藥量為500 mL/株。②病斑涂抹施藥。先將病斑刮除干凈，用無菌棉球蘸取稀釋液對發病部位進行涂抹，以蘸取無菌水涂抹作對照。每處理涂抹50個病斑，間隔7 d施藥1次，共施藥3次。③灌根施藥。首先灌清水測算出每株獼猴桃用水量，以保證植物根系土壤濕潤為準，用藥量為1 L/株，間隔7 d施藥1次，共施藥3次。

挑選長勢均一的獼猴桃植株，每個處理10株，3次重復，隨機排列。采用針刺接種法[16]對獼猴桃樹苗進行病原菌接種，接種后用保鮮膜纏繞接種處保濕48 h，后續采用常規田間管理。

1.2.2.2 單項施藥試驗設計。

單項施藥試驗于2015年10—11月進行。噴霧和灌根施藥為一組試驗，涂抹施藥為獨立的試驗。每個試驗有8個處理：①Tr309T-WP 125倍；②Tr309T-WP 250倍；③Tr309T-WP 500倍；④Tr309T-SC 125倍；⑤Tr309T-SC 250倍；⑥Tr309T-SC 500倍；⑦2% 潰腐靈SC 100倍；⑧病原對照。

1.2.2.3 組合施藥試驗設計。

組合施藥試驗共有7個處理：①Tr309T-WP 250倍噴霧+涂抹；②Tr309T-WP 250倍噴霧+涂抹+灌根；③Tr309T-SC 250倍噴霧+涂抹；④Tr309T-SC 250倍噴霧+涂抹+灌根；⑤2%潰腐靈SC 100倍噴霧+涂抹；⑥2% 潰腐靈SC 100倍噴霧+涂抹+灌根；⑦病原對照。

試驗在2016年3月 4日第1次施藥，后續施藥間隔為7 d，共施藥3次；第2年開始用藥時間為2017年3月22日，施藥方法與單項施藥一致。

1.2.2.4 調查方法。

①噴霧施藥。分別調查第1次施藥前及末次用藥后7 d的發病情況，記錄發病株數和病情指數（DS），統計發病率及防治效果（ERDC）。

②病斑涂抹施藥。于施藥前掛牌標記病斑，末次施藥后7 d調查復發病斑數，計算病斑治愈率。③灌根施藥調查方法與噴霧防治試驗相同。

④組合施藥。調查末次藥后7 d的發病情況，調查方法與單項施藥相同，記錄DS，計算ERDC。

⑤病害分級標準見表 1。

2 結果與分析

2.1 木霉菌株與PSA平板拮抗篩選結果

由表2可知，各木霉菌株以及PSA均能在PDA上生長良好，并在5 d內覆蓋整個平板。在混合涂布的平板上，Tr14、Tr25、Tr34、Tr64、Tr121分別只在稀釋濃度為1×10-5個/mL的平板上抑制了PSA的生長，而在稀釋濃度為1×10-6、1×10-7、1×10-8個/mL的平板上，PSA則抑制了這些木霉菌株的生長。只有 Tr309T 在稀釋濃度為1×10-8～1×10-5個/mL的所有平板均抑制了PSA的生長。因此，選擇Tr309T，將其制成可濕性粉劑與懸浮劑，繼續在大田進行施藥方法和劑型的藥效試驗。

2.2 單項施藥試驗結果

結果顯示（表3、4），噴霧和灌根2種施藥方式下，經Tr319-WP 和 Tr319-SC處理的獼猴桃植株的ERCD均隨著施藥量的增加而提高，但均顯著低于2% 潰腐靈SC化學藥劑處理。在涂抹施藥方式下，經Tr319-WP 和 Tr319-SC處理的獼猴桃植株的RRDS均隨著施藥量的增加而提高，但均顯著低于2%潰腐靈SC化學藥劑處理。

2.3 組合施藥試驗結果

2年組合施藥試驗結果（表5）表明，在組合施藥A方式下，Tr309T-WP、Tr309T-SC、2%潰腐靈處理的DS顯著低于病原對照處理（2016年：72.84；2017年：80.03）；在組合施藥B方式下，Tr309T-WP和2%潰腐靈SC處理的DS或ERCD都顯著高于或低于Tr309T-SC處理。

3 結論與討論

針對獼猴桃潰瘍病的防治，田間管理和化學藥劑防治是果農目前采用的主要手段[16]。較為有效的化學藥劑有2類，分別是含銅制劑和農用鏈霉素類。秦虎強等[17]利用72%農用鏈霉素SPX和4%氫氧化銅WG對獼猴桃潰瘍病進行防治，防效分別達76.6%和73.4%。龍友華等[18]發現40%硫酸鏈霉素50倍稀釋液對潰瘍病的田間防效在78.7%以上。然而，含銅制劑常常會對獼猴桃葉片造成藥害，而且長期使用鏈霉素會使病原菌對其產生抗藥性[19]。該研究結果顯示，利用木霉菌制劑對該病害進行防治，不僅在防治效果上與化藥相似，同時不會對植物造成藥害，也不會對環境造成污染。謝俊等[15]在開發防治獼猴桃潰瘍病的木霉菌生物制劑時發現，與可濕性粉劑相比，油懸浮劑具有滲透性和黏附性強、抗蒸發、耐雨水沖刷、增效等優點。羅秀[20]在防治稻縱卷葉螟研究中發現，白僵菌可分散油懸浮劑對卷葉螟的防治效果明顯優于蘇云金桿菌可濕性粉劑。該研究采用的組合施藥對比試驗有相似的結果。經木霉菌Tr309T-SC組合施藥A或B 處理的獼猴桃植株，在防治效果上都分別好于經木霉菌Tr309T-WP處理的植株。說明油懸浮劑能使木霉菌更好地附著在獼猴桃植株上，不易被雨水沖刷，有助于木霉菌在獼猴桃地上部分發揮藥效。

張鋒等[10]在防治獼猴桃潰瘍病的組合施藥技術上采用了噴霧+涂抹、噴霧+灌根、灌根+涂抹，并發現噴霧+涂抹組合的防治效果最佳。該研究在噴霧+涂抹組合的基礎上，增加了灌根處理（組合施藥B），顯著地提高了對獼猴桃潰瘍病的防治效果。孫虎等[21]、邱德文[22]研究發現，灌根能將木霉菌接種至作物根部，使其在根際土壤中定殖并改善根際土壤環境，增強作物長勢，并誘導作物對多種病害產生系統抗性。Viterbo等[23]通過灌根，將綠色木霉菌接種到黃瓜幼苗根部，使黃瓜對細菌性角斑病產生系統抗性。

為加速綠色農業的可持續發展，環境友好型的生物農藥越來越受到青睞。許多學者已對利用EM菌[24]、芽孢桿菌[11]和放線菌[14]等防治獼猴桃潰瘍病進行了多方面的研究。但利用生防真菌防治獼猴桃潰瘍病的研究還鮮有報道。該研究通過對木霉菌株的篩選，對合適的劑型以及施用方法進行了多項測試，為有效防治獼猴桃潰瘍病提供了依據。

參考文獻

[1] 李黎，鐘彩虹，李大衛，等.獼猴桃細菌性潰瘍病的研究進展[J].華中農業大學學報，2013，32（5）：124-133.

[2] OPGENORTH D C，RICHTER G Y，ALLEN D J，et a1.Pseudomonas canker of kiwifruit[J].Plant disease，1983，67（11）：1283-1284.

[3] 方炎祖，朱曉湘，王宇道.湖南獼猴桃病害調查研究初報[J].四川果樹科技，1990（1）：28-29.

[4] 屈金亮，鄭海紅，張永信，等.獼猴桃細菌性潰瘍病的分布、侵染途徑與防治技術[J].河北果樹，2012（3）：48-49.

[5] 韓明麗，張志友，陳麗萍，等.獼猴桃潰瘍病發生的影響因素及其防治方法[J].湖南農業科學，2013（21）：77-80.

[6] 李泉廠，陳金煥，王西紅.不同藥劑防治獼猴桃潰瘍病效果研究[J].現代農業科技，2013（11）：130-131.

[7] 高小寧，趙志博，黃其玲，等.獼猴桃細菌性潰瘍病研究進展[J].果樹學報，2012，29（2）：262-268.

[8] 馮華，李海洲.周至縣獼猴桃潰瘍病流行規律及其綜合防治措施[J].中國植保導刊，2009，29（11）：29-30.

[9] 高蓬明，王瑞，馬立志.獼猴桃潰瘍病防治藥劑的室內毒力及田間防治效果[J].貴州農業科學，2013，41（4）：85-88.

[10] 張鋒，陳志杰，張淑蓮，等.獼猴桃潰瘍病藥劑防治技術研究[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2005，33（3）：71-75.

[11] 盛存波，安德榮，魯燕汶，等.一株抗獼猴桃潰瘍病的芽孢桿菌分離和篩選研究初報[J].中國農學通報，2005，21（12）：346-348.

[12] 盛存波，安德榮，魯燕汶，等.生防菌株B56-3防治獼猴桃潰瘍病的初步研究[J].西北農業學報，2006，15（3）：75-78.

[13] 邵寶林，王成華，劉露希，等.獼猴桃潰瘍病生防芽孢桿菌B2的鑒定及應用[J].中國農學通報，2015，31（26）：103-108.

[14] 申哲，黃麗麗，涂璇，等.植物內生放線菌活性物質防治獼猴桃潰瘍病[J].中國生物防治，2008，24（4）：329-334.

[15] 謝俊，阿吉拉·阿拉亞·馬爾塞格·埃斯特班，金錫萱，等.木霉菌油懸浮劑的研制[J].農藥，2017，56（1）：18-22.

[16] 方中達.植病研究方法[M].北京：中國農業出版社，1998.

[17] 秦虎強，趙志博，高小寧，等.四種殺菌劑防治獼猴桃潰瘍病的效果及田間應用技術[J].植物保護學報，2016，43（2）：321-328.

[18] 龍友華，夏錦書.獼猴桃潰瘍病防治藥劑室內篩選及田間藥效試驗[J].貴州農業科學，2010，38（10）：84-86.

[19] SERIZAWA S，ICHIKAWA T，TAKIKAWA Y，et al.Occurrence of bacterial canker of kiwifruit in Japan：Description of symptoms isolation of the pathogen and screening of bactericides[J].Annals of the phytopathological society of Japan，1989，55：427-436.

[20] 羅秀.白僵菌可分散油懸浮劑防治稻縱卷葉螟的藥效研究[J].耕作與栽培，2014（4）：56-57.

[21] 孫虎，楊麗榮，全鑫，等.木霉生防機制及應用的研究進展[J].中國農學通報，2011，27（3）：242-246.

[22] 邱德文.我國植物病害生物防治的現狀及發展策略[J].植物保護，2010，36（4）：15-18.

[23] VITERBO A，HAREL M，HORWITZ B A，et al.Trichoderma mitogenactivated protein kinase signaling is involved in induction of plant systemic resistance[J].Applied and environmental microbiology，2005，71（10）：6241-6246.

[24] 楊清平，王立華，胡楠.EM菌對獼猴桃潰瘍病的防治試驗[J].福建林業科技，2015，42（1）：100-102，114.