污染物對無脊椎動物乙酰膽堿酯酶活性的影響研究進展

劉文秀

摘要 從無脊椎動物的角度，綜述了乙酰膽堿酯酶的特性及其在國內外的研究進展，并對該領域研究前景進行了展望，旨在為環境監測、農藥殘留及疾病治療等方面提供科學依據。

關鍵詞 無脊椎動物；乙酰膽堿酯酶；污染物

中圖分類號 S859.82 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）02-0004-04

Abstract We summarized the characteristics of acetylcholinesterase and its research progress at home and abroad from the perspective of invertebrates. The research foreground of this field was prospected， so as to provide scientific basis for environmental monitoring， pesticide residue，disease treatment and so on.

Key words Invertebrates；Acetylcholinesterase；Contaminants

隨著工農業生產的發展，各種廢水大量排放，再加上化學農藥的不合理使用，使得環境污染問題日益嚴重，對生態環境及人類安全造成一定影響，引起了世界各國的普遍關注。大多數無脊椎動物個體小，生活自由，容易受環境影響，適宜研究生態毒理作用，并被作為潛在環境污染的篩選工具[1]。其中，枝角類作為指示生物檢測400多種化學物的毒性[2]。

乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是生物神經傳導中的一種關鍵性酶，在膽堿能突觸間，該酶能降解乙酰膽堿（ACh），終止神經遞質對突觸后膜的興奮作用，保證神經信號在生物體內的正常傳遞。大多數污染物是AChE的抑制劑，進入環境后，影響生物機體AChE的活性，造成大量動物的死亡。為了避免這種現象的發生，國內外學者就不同污染物對動物AChE的毒理學機制進行了研究。筆者從無脊椎動物的角度，綜述了AChE的特性以及作為神經傳導的標志物在該領域的研究進展，旨在為生態環境監測、農藥殘留及疾病治療等提供科學依據。

1 乙酰膽堿酯酶的性質

1.1 蛋白質結構和基因結構

從蛋白結構來看，AChE最突出的特征就是有一個深而窄的狹口，活性基團位于此狹口中，而活性中心主要由以下3個部分組成（圖1）：①酯解部位，主要由絲氨酸和組氨酸組成，可以與乙酰膽堿的羧基碳原子結合；②季銨基團結合部位，ACh含季銨陽離子部分，與AChE活性中心上的陰離子部位結合；③疏水性區域，該區域有色氨酸或酪氨酸等芳香族氨基酸，與酯解或季銨基團結合部位連接或在其附近，在與芳香族底物結合中起重要作用[3]。

從基因結構來看，自1986年黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的第1個AChE基因被克隆以來，生物體內的AChE催化亞基的cDNA逐步被發現，這些cDNA均編碼1個長度535個氨基酸左右的多肽鏈。絕大部分生物的AChE由單個Ace基因編碼，但線蟲基因組中有4種Ace基因（Ace-1、Ace-2、Ace-3、Ace-4），棉蚜（Aphis gossypii）、桃蚜（Myzus persicae）、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）和三帶喙庫蚊（Culex tritaeniorhynchus）4種昆蟲中發現2種Ace基因（Ace-1、Ace-2）[5]。不同生物間Ace的堿基長度、內含子、外顯子數目不同，結構就不同，所以它們編碼的AChE對抑制劑的敏感性也不同。

根據NCBI數據庫中得到不同物種AChE的基因序列，利用MEGA 5.1軟件構建了系統發育樹（圖2），顯示了不同物種間AChE基因的親緣關系：大型溞Daphnia magna（AB697764.1）、玻璃海鞘Ciona intestinalis（NM_001128877.1）、

斑馬魚Danio rerio（NM_131846.2）、家蠅Musca domestica（AF533335.1）、鯉魚Cyprinus carpio（AB361595.1）、河鲀Tetraodon nigroviridis（AY733039.1）、橄欖星室木虱Pseudophacopteron canarium（DQ425058.1）、根結線蟲Meloidogyne javanica（AF080184.1）、馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata（GU066339.1）、

巴氏白蛉Phlebotomus papatasi（JQ922267.1）、藥材甲Stegobium paniceum（GU944767.1）、盲鰻Myxine glutinosa（U55003.1）、催命按蚊Anopheles funestus（JN815138.1）、廄螫蠅Stomoxys calcitrans（HM125963.1）、

擬黑多刺蟻Polyrhachis vicina（JF742990.1）、螺旋蠅Cochliomyia hominivorax（FJ830868.1）、埃及血吸蟲Schistosoma haematobium（AY228511.1）、南方根瘤線蟲Meloidogyne incognita（AF075718.1）、煙草甲Lasioderma serricorne（GU211888.1）、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis（FN538987.1）、褐飛虱Nilaparvata lugens（FM866396.2）。結果發現，家蠅、廄螫蠅和螺旋蠅三者間的親緣關系較近，根結線蟲和南方根瘤線蟲的AChE基因也比較相似，而按蚊與其他物種的AChE基因的親緣關系相對較遠。這些物種間AChE基因親緣關系的遠近可能就是由于其編碼基因的不同所造成的。

1.2 乙酰膽堿酯酶的生物學功能

AChE是生物體內反應速度最快的酶之一（Kcat=1.6×104 s-1），是絲氨酸水解酶最重要的家族成員之一，在脊椎動物和無脊椎動物體內都有分布，是生物神經傳導中的一種關鍵性的酶，調節ACh轉換，負責終止跨突觸的許多神經元細胞信息的傳遞。AChE是一種多分子型的復雜蛋白質，在中樞及外周神經系統與ACh受體一起完成神經之間動作電位的傳遞，從而保證神經信號在生物體內的正常傳遞[6]。

在生態毒理學中，AChE被認為是神經系統中膽堿能信號傳導的最重要的生物標志物，因此AChE活性檢測被廣泛應用于研究中，酶抑制是化學誘導的神經毒性的征兆[7]。在環境監測中，無脊椎動物的AChE常被作為指示劑，監測環境中污染物的含量。AChE可能與細胞的發育和成熟有關，此外，有研究發現利用不同方式誘導細胞凋亡，均檢測到AChE的表達，且AChE的反義核酸可以部分抑制細胞凋亡，說明AChE對細胞凋亡有一定的影響[8]。醫學研究發現，AChE促進釋放ACh時，致使迷走神經興奮，表現為心率減慢、血管擴張、消化道平滑肌收縮、消化腺分泌增加等，從而引起胃腸蠕動。楊筱珍等[9]研究發現，通過腸道鋪片和組化染色的方法發現在中華絨螯蟹后腸中廣泛存在AChE，促進腸道的排泄，腸胃蠕動加劇，使機體攝食率增加。

1.3 乙酰膽堿酯酶的分布情況

在不同無脊椎動物體內，AChE的含量和組織分布均存在差異。研究發現，AChE主要合成于肝臟，存在于肌肉、肝胰、心臟、腸黏膜、血漿及神經組織（如腦白質、神經細胞髓鞘）等，其中在腦組織中的AChE含量最高[3]。在組織中，也主要存在于膽堿能神經末梢突觸間隙，特別是運動神經終板突觸后膜的褶皺中聚集較多。

2 國內外對乙酰膽堿酯酶的研究進展

2.1 污染物對生物體內乙酰膽堿酯酶活性的影響 1953年，Stedman等首先從馬血清中分離出AChE后，不同生物體內的AChE相繼得到分離和研究，對AChE的研究也更加廣泛。

工業上，不同形式的金屬廢物排入環境中，在生物體內富集，尤其在低等的無脊椎動物體內，直接影響機體AChE的活性，對動物的生長發育造成一定傷害。李會等[10]研究發現暴露在 60 mg/L Fe3+溶液中，泥鰍腦組織中AChE活性顯著降低（P<0.05），表明 Fe3+對泥鰍具有神經毒性。暴露于毒死蜱（CHP）和Cu后，紫貽貝鰓中AChE的活性也顯著降低[11]。然而，暴露在納米顆粒TiO2中的扇貝組織鰓和消化腺內的AChE活性都隨時間的增長呈上升趨勢，表現出時間-劑量效應關系[12]。納米形式的金屬對機體AChE的影響都不是特別明顯，只有達到一定時間和劑量才會起作用。暴露在ZnO納米顆粒下的蜜蜂，腦組織中AChE的活性基本不受影響[13]。據此推測，可能是金屬的納米形式比離子形式的毒性小，對AChE的抑制作用也較弱。

除了金屬物質外，各種藥物排入環境中，對AChE也會產生一定的影響。張丹等[14]研究發現在亞致死濃度（LC5、LC10和LC20）脅迫下，氧化樂果、甲萘威和辛硫磷對搖蚊幼蟲AChE活性都有明顯的抑制作用。熏蒸劑對谷物象鼻蟲的AChE也有顯著的抑制作用[15]。相同地，暴露在反式肉桂醛下，果蠅AChE活性表現出顯著的抑制作用[16]。以上污染物都對無脊椎動物機體AChE表現出抑制作用，然而可能由于化學藥物的不同特性，對AChE會有不同的作用。溴化1-乙基-3-甲基咪唑對斜紋夜蛾AChE活性的影響在LC20濃度處理下呈抑制趨勢，LC50濃度處理下呈先抑制后誘導的趨勢；溴化1-丁基-3-甲基咪唑對斜紋夜蛾AChE活性的影響在LC20濃度處理下呈先抑制后誘導的趨勢，在LC50濃度處理下呈抑制趨勢；1，2-二甲基咪唑對斜紋夜蛾AChE活性的影響在LC20濃度處理下呈先抑制后誘導的趨勢；在LC50濃度處理下呈先誘導后抑制的趨勢，3種離子液體在斜紋夜蛾體內的積累對體內AChE的活性均有不同程度影響，改變生物體內神經信號的傳導，導致生物體嚴重的行為改變、功能紊亂、癱瘓，從而產生毒害作用[17]。Deng等[18]研究發現低濃度的毒死蜱短期對小菜蛾體內AChE的活性增加23.5%～29.8%。同時暴露在殺蟲劑氯蟲苯甲酰胺和真菌病原體的東亞飛蝗體內AChE活性在后期也呈上升趨勢[19]。

隨著對AChE研究的不斷擴展延伸， AChE的應用已經深入到醫藥或疾病治療等領域。醫學研究發現，AChE不僅參與膽堿能神經遞質的傳遞，而且具有調節和促進神經組織的發育和神經再生的神經營養因子樣作用。Prugh等[20]研究表明暴露于有機磷的間充質干細胞（MSC）的AChE活性降低， 造成MSC分化成成骨細胞的能力降低。大量醫學研究表明，目前用于阿爾茨海默病（AD）的治療主要基于AChE抑制劑的給藥[21]，且已經在臨床上得到實踐。

2.2 乙酰膽堿酯酶活性改變的機理

基于目前國內外對AChE的廣泛研究，污染物對生物體AChE的毒性研究越來越受到關注，尤其各種農藥對無脊椎動物毒性反應的影響已經成為焦點[22-23]。當污染物進入機體與AChE相互作用時，與AChE活性中心的絲氨酸發生不可逆反應，產生一個更穩定的污染物-乙酰膽堿酯酶絡合物，使AChE不能有效水解ACh，在體內大量積累，受體不斷被激活，突觸后神經纖維長期處于興奮狀態，引起戰栗、痙攣[24]。然而，過量的ACh又可以造成去極化阻斷，從而抑制了神經傳導，使機體后期逐漸失去活動能力，昏迷死亡。

不同污染物對AChE的影響程度還取決于污染物和酶的化學特性。AChE有多個不同的結合部位，不同污染物對它們的結合能力不同，影響作用也不同。Dos Santos Miron等[24]研究發現污染物誘導AChE活力上升，推測可能是由于機體在應對外源污染物時的一種應激機制，通過加快AChE的合成來補償污染物對機體產生的脅迫。AChE活力升高表明神經遞質膽堿水解增強，引起煙堿和毒蕈堿受體活化下降，造成正常的神經信息傳遞也受到影響，導致實驗動物中毒。AChE活性的下降，表明污染物濃度的升高，對機體的神經毒性增大，酶活力中心絲氨酸受到抑制，酶的結構發生改變，酶失活；也可能是因為大量的活性氧自由基抑制了酶的活力[25]。

2.3 污染物對水溞乙酰膽堿酯酶的影響

枝角類作為食物鏈中的關鍵物種，在食物鏈中起重要的作用。水溞營養價值高、繁殖快、適口性好，適合大量培養，是許多水產品動物的餌料，對多種有毒物質敏感，是毒性試驗中普遍采用的標準試驗材料。因此，枝角類的餌料價值和應用前景已引起國內外學者的廣泛關注。通過對污染物脅迫無脊椎動物AChE機理的研究，分析污染物對水溞AChE活性的影響。

研究發現，對乙酰氨基酚（鎮痛藥）和雙氯芬酸（抗炎藥）的攝入顯著抑制了大型溞的AChE活性，說明對乙酰氨基酚和雙氯芬酸具有干擾大型溞神經傳遞的能力[26]。Toumi等[27]研究表明將大型溞暴露在氰菊酯和擬除蟲菊酯殺蟲劑下，AChE活性均顯著降低。大型溞在AgNPS下脅迫48 h，隨著AgNPS濃度的升高，AChE活性升高，與Ulm等[28]的研究結果一致。

通過對水溞AChE的研究，發現不同污染物對水溞AChE有不同程度的影響，這可能與污染物的化學特性有關，不同污染物與機體酶的結合能力不同，而且對AChE的效應時間和劑量也不同。

3 小結與展望

AChE是生物神經傳導中的一種關鍵性的酶。低等無脊椎動物在污染物的脅迫下，AChE可作為一種生物指示劑來監測環境的污染情況。大量研究表明，大多數無脊椎動物在污染物的脅迫下，AChE活性隨著污染物濃度的升高會呈現下降趨勢，使得動物機體神經中毒，甚至導致死亡。

水溞作為一種甲殼類水生動物，在水環境系統食物鏈中起著關鍵作用。當機體受到污染物脅迫時，水溞AChE能迅速發生變化，為監測水質污染、保護生態環境和防治污染物提供科學依據，同時也可為今后研究工作的開展奠定理論基礎并提供技術支撐。

隨著分子技術、基因工程和計算機模擬技術等的發展，這些成果被廣泛應用到水環境污染監測、農藥殘留檢測、生態環境保護以及人類疾病治療等領域。利用分子生物學技術，檢測水體動物體內AChE的活性及其基因等一系列變化來反映水環境的污染情況。通過點突變技術和基因克隆技術獲得對有機磷和氨基甲酸酯類化合物敏感的乙酰膽堿酯酶的cDNA序列，利用基因克隆使其在微生物中大量表達，提取大量敏感性的AChE，用于研制生物傳感器，檢測農產品或環境中的有機磷和氨基甲酸酯類農藥的含量[29]。在疾病防治方面，某些疾病（如阿爾茨海默病、重癥肌無力病等）的發生也與AChE有密切的關系。Zhang等[30]研究發現在動物細胞凋亡過程中會表達特異性帶尾親水型的AChE，這為腫瘤以及其他功能性疾病的檢測提供了新思路。

參考文獻

[1]ZEIN M A，MCELMURRY S P，KASHIAN D R，et al.Optical bioassay for measuring sublethal toxicity of insecticides in Daphnia pulex[J].Environmental toxicology & chemistry，2014，33（1）：144-151.

[2] SNCHEZBAYO F.Comparative acute toxicity of organic pollutants and reference values for crustaceans.I.Branchiopoda，Copepoda and Ostracoda[J].Environmental pollution，2006，139（3）：385-420.

[3] 何東海，孟范平，朱小山.有機磷農藥對海洋動物乙酰膽堿酯酶（AChE）的毒性效應研究進展[J].海洋通報，2003，22（6）：71-78.

[4] 孫曼霽，周廷沖.乙酰膽堿酯酶的結構和功能[J].生物化學與生物物理進展， 1981（3）：1-4.

[5] 劉銘鈞，李盾，高俊娥.乙酰膽堿酯酶基因工程技術研究進展[J].生物技術，2008， 18（2）：84-87.

[6] ESCARTN E，PORTE C.Bioaccumulation， metabolism， and biochemical effects of the organophosphorus pesticide fenitrothion in Procambarus clarkia[J].Environmental toxicology & chemistry，1996，15（6）：915-920.

[7] WIKLUND A K E，ADOLFSSONERICI M，LIEWENBORG B，et al.Sucralose induces biochemical responses in Daphnia magna[J].PLoS One，2014， 9（4）：1-6.

[8] 吉麗娜.乙酰膽堿酯酶在細胞凋亡中的作用[D].上海：中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，2006.

[9] 楊筱珍，黃堅，李彤，等.中華絨螯蟹中腸和后腸內AchE和NOS神經元的觀察以及Ach、NO含量和Na+，K+-ATP活性的分析[J].水產學報，2015，39（7）：989-997.

[10] 李會，付崇羅，張亮. Fe3+對泥鰍腦組織AChE活性的影響[J].湖北農業科學， 2014（10）：2373-2375.

[11] PERIC′ L，NERLOVIC′ V，URGA P，et al.Variations of biomarkers response in mussels Mytilus galloprovincialis to low， moderate and high concentrations of organic chemicals and metals[J].Chemosphere，2017，174：554-562.