草銨膦對油菜種子萌發和根尖細胞遺傳毒性的影響

周文濤

摘要 [目的]探討草銨膦對油菜種子萌發和根尖細胞遺傳毒性的影響。[方法]模擬不同濃度和處理時間下，低劑量草銨膦殘留對甘藍型油菜萌發后幼苗生長初期的生長發育和根尖細胞分裂活動的影響。[結果]草銨膦處理對油菜發芽期幼苗下胚軸、初生根等性狀的抑制效果隨處理濃度的升高和處理時間的延長而增強；0.000 01%的草銨膦殘留即可對油菜地上部分和地下部分產生明顯的抑制效果，下胚軸對草銨膦的敏感性顯著大于初生根；0.005%的草甘膦處理根尖4 h可顯著抑制油菜根尖分生區細胞的有絲分裂，其抑制作用隨濃度的升高和處理時間的延長逐步增強，并可誘發細胞產生染色體橋、染色體落后、多級分裂、間期微核、染色體濃縮等染色體變異。[結論]試驗結果為草銨膦在油菜田使用的安全性評估提供了理論依據。

關鍵詞 油菜；草銨膦；種子萌發；染色體變異；有絲分裂

中圖分類號 S482.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）02-0120-04

Abstract [Objective] The aim was to study the effects of herbicide glufosinate on seedling growth and morphological root tips cell genetic toxicity on Brassica napus. [Method] Under the conditions of different concentrations and different treatment duration， effects of herbicide glyphosate on seed germination and morphological root tips division activity of Brassica napus were studied. [Result] The inhibitive effects of glufosinate treatments on rapeseed hypocoty and primary root morphological characters were enhanced along with the increase of treatment concentrations and durations. The 0.000 01% glufosinate could inhibit the growth of hypocoty significantly. The inhibitive effects of glufosinate treated for hypocotyl was significantly greater than primary root；the mitosis in root tip cells treated by the 0.005% glufosinate for 4 h could be significantly inhibited， and its inhibition effects were enhanced along with the increase of treatment concentrations and durations， and induced cells to produce chromosome bridge， chromosome lagging， multilevel division， interphase micronucleus， chromosome enrichment genetic effect， etc.. [Conclusion] The results provide reference for safety assessment of glufosinate applied in Brassica napus field.

Key words Rapeseed；Glufosinate；Seed germination；Chromosome disorder；Mitosis

油菜是世界主要的經濟作物之一。隨著高產、優質油菜品種的培育和推廣，油菜種植面積不斷擴大，油菜田雜草發生也呈逐年上升趨勢。目前，油菜田雜草以化學防除為主。草銨膦（Glufosinate）是一種廣譜非選擇性的除草劑，其對植物的地上部分和地下部分均有殺死作用[1]，屬滅生性莖葉處理劑[2]，靶標酶為谷氨酰胺合成酶（GS）[3]，草銨膦抑制GS可以導致植物體內氮代謝失調，必需氨基酸的合成受阻，從而降低肽、蛋白質與核苷酸生物合成，光合作用受抑制，最終導致植物死亡[4]。草銨磷由于具有活性高、藥效快、非選擇性、無土壤活性等優點[5]，越來越被人們接受，并廣泛應用。正是由于草銨膦的非選擇性，在殺死雜草的同時也影響了農作物的正常生長發育，所以草銨膦對作物生長的影響的研究顯的尤為重要。根尖是萌發種子在土壤中首先接觸除草劑的器官，張帆等[6]研究發現新型除草劑丙酯草醚抑制發芽期油菜的苗高、根長、側根數、干物質積累等，并且抑制根尖細胞的有絲分裂。若要在直播油菜田推廣應用，需要評價其對發芽期油菜幼苗的安全性問題。化學除草雖然高效，但在實際使用中會對主栽作物產生影響或有藥物殘留，如何使其對主栽品種的藥害降到最低，對農業生產的影響減到最小，成為目前亟待解決的問題[7]。

筆者通過形態學方法研究了微量濃度草銨膦對油菜幼苗根莖長、側根數等性狀的影響，并進一步通過根尖壓片法對草銨膦的細胞學毒性進行了觀察，研究了草銨膦殘留毒性對后茬油菜幼苗生長的影響，旨在為草銨膦在油菜田使用的安全性評估提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料。甘藍型油菜（Brassica napus L.）中雙11號，由西南大學油菜工程技術中心提供。選取種皮光亮、飽滿的種子，播于鋪有2層定性濾紙的直徑6 mm的培養皿內，每皿30粒，置于光照培養箱中使其萌發，溫度26 ℃，光照16 h，黑暗8 h。

1.1.2 供試藥劑。

草銨膦：永農牌百速頓草銨膦，永農生物科學有限公司生產（產地：中國浙江）。有效成分含量為200 g/L。

1.2 方法

1.2.1 除草劑對地上和地下部分形態性狀的影響試驗。播種后分別用有效含量為0.000 01%、0.000 10%、0.001 00%、0.010 00%的草銨膦水溶液使其萌發，分別處理1、2、3、4、5 d，以去離子水為對照，每處理設10次重復，6 d后選取長勢均勻的10株幼苗，測量下胚軸和初生根長度，統計側根數。

1.2.2 除草劑對根尖細胞分裂的影響試驗。用清水進行種子萌發，待其初生根長至1.0 cm左右時分別用有效含量為0.005%、0.010%、0.050%、0.100%、0.500%、1.000%的草銨膦溶液浸根，每個濃度分別處理4、8、12、16、20、24 h，以清水作為對照，采用卡諾氏固定液固定24 h，根尖保存于70%乙醇中。用去離子水將保存的根尖沖洗干凈，置于1 mol/L HCl中，60 ℃水浴中解離6 min后用去離子水沖洗干凈，卡寶品紅染色，壓片，在光學顯微鏡下觀察記錄根尖分生組織細胞有絲分裂指數和各種異常細胞出現頻數并照像，每處理組觀察4個根尖，每個根尖觀察約2 000個細胞。

1.3 數據分析

所有數據及制圖使用SPSS 17.0統計軟件和Excel 2007軟件進行，采用LSD法分析差異顯著性。有絲分裂指數（MI）=分裂期細胞總數/觀察細胞總數×100%[8-9] 。

2 結果與分析

2.1 草銨膦對油菜幼苗生長發育的影響

草銨膦對油菜幼苗地下和地上部分均有抑制作用（表1和圖1），其抑制效果隨處理濃度的升高和處理時間的延長而增強；在0.000 01%草銨膦處理下，處理后1 d地上部分下胚軸的長度受到了顯著抑制，而0.000 01%草銨膦即使處理5 d后也未能引起地下部分初生根根長的顯著變化，0.000 10%草胺膦處理4 d后地下部分初生根才受到明顯抑制，相比之下，地上部分對草銨膦更敏感；側根數從處理1 d后開始就受到了明顯抑制，0.001 00%草胺膦處理4 d后已完全抑制了側根的發生；下胚軸/初生根長在低濃度（0.000 01%～0.001 00%）草銨膦短時間（1～3 d）處理下與對照無顯著差異（圖2），表明在試驗濃度和處理時間下，草銨膦對地上部分和地下部分的抑制作用大致相同。0.000 10%草銨膦處理5 d后，下胚軸/初生根長達到最大值（2.20），之后隨濃度的增加而下降。

2.2 草銨膦對油菜根尖細胞遺傳毒性的影響

2.2.1 草銨膦處理對油菜幼苗根尖有絲分裂的影響。

用不同濃度和不同時間的草銨膦處理油菜幼苗根尖，對其分生組織進行壓片觀察。結果表明，草甘膦能顯著影響根尖細胞的有絲分裂指數，用不同濃度的草銨膦處理后，細胞有絲分裂指數與對照相比均有不同程度的降低，表明有絲分裂活動受到抑制。當濃度為0.005%時，有絲分裂指數在3.42%～1.63%；濃度為0.010%時，有絲分裂指數在2.29%～0.82%；濃度為0.050%時，有絲分裂指數在1.40%～0.81%；濃度為0.100%時，有絲分裂指數在0.75%～0.29%；濃度為0.500%時，有絲分裂指數在0.30%～0.05%；隨著處理濃度的增加，有絲分裂指數逐漸下降，也就是說，有絲分裂活動受到的抑制作用更明顯（圖3）。

2.2.2 草銨膦對油菜根尖細胞毒害作用的異常細胞形態觀察。

油菜幼苗期根尖經草甘膦處理后，在處理組均檢測到了多種異常有絲分裂[10]的細胞，如染色體橋、滯后染色體、微核、斷裂染色體、多級、染色體黏連、染色體濃縮等現象，其中染色體橋是最容易觀察到的現象（圖4）。橋是由于2條染色體斷裂后融合形成的，當2條染色體的著絲粒已經分別移向相對的兩極時，二者的臂仍然黏連在一起，形成后期的橋，染色體橋可以導致染色體結構的變異，該試驗中觀察到的染色體橋有單橋、雙橋、三橋和多橋等類型。該研究發現，0.005%草銨膦處理4 h即可引起染色體畸變，當濃度增大到1.000%時，各處理時間段均未在分裂期細胞里觀察到畸變染色體，染色體畸變率在0～15.63%，這些異常有絲分裂的細胞在CK中均未觀察到。

3 結論與討論

草銨膦是廣譜、苗后、非選擇性除草劑，它通過對GS不可逆抑制，造成植物氮代謝失調，必需氨基酸缺乏，最終導致細胞內氨的含量過量而中毒，隨之葉綠素解體，植物死亡[11]。草銨膦的傳導性較差，但草銨膦既可以在植物體內隨蒸騰流在木質部內向上運輸，也可以在韌皮部內向地下部分運輸[12]。該研究用不同濃度的草銨膦處理萌發期的油菜種子，發現草銨膦對萌發期油菜下胚軸和初生根都有抑制作用，且地上部分下胚軸對草銨膦更敏感。通過對不同濃度草銨膦處理的根尖分生區細胞進行壓片觀察還發現，除草劑草銨膦能抑制油菜根尖細胞的有絲分裂，推斷可能是由于草銨膦抑制了細胞分裂過程中一些芳香氨基酸的合成，進而使細胞分裂過程中某些蛋白質的合成受阻，如抑制G2期DNA的合成[13]，從而抑制了細胞分裂，進而抑制了油菜幼苗的生長發育。也有研究表明，除草劑抑制細胞分裂與微管蛋白的合成有關[14]。此外，在壓片觀察時還發現了異常分裂的細胞，如落后染色體、染色體橋、多級分裂、微核等。細胞經輻射或化學藥物的作用易導致分裂過程滯留染色體形成落后染色體、染色體橋、染色體斷片、環狀染色體等染色體畸變。由于末端黏連而出現雙著絲粒染色體，在其以后分離時就形成了染色體橋。除草劑還可能破壞了紡錘絲的正常結構和功能[15]，使個別染色體分離滯后或出現多極分裂現象。微核的形成存在多種學說[16]，而草銨膦最傾向于化學誘變學說，當細胞受到草銨膦作用后造成紡錘絲損傷或染色體斷片，在細胞分裂后期，這些斷片或落后的染色體不能進入細胞核而凝聚形成微核游離在細胞質中。除草劑影響細胞遺傳毒性的分子機制有待進一步研究。

該研究發現，即使百萬分之一的草銨膦也會對油菜幼苗生長產生明顯抑制作用，雖然草銨膦在土壤中易通過各種形式降解[4]，但若有微量草銨膦飄逸到附近農作物、果樹、蔬菜[17-18]等綠色植物上，也會給生產者帶來較大損失，甚至危害農田生態。

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