基于UHPLC—ESI—Q—TOFMS分析燈盞細辛提取物的血漿移行成分

王愛民

摘要 [目的]采用超高效液相色譜-電噴霧-四級桿-飛行時間串聯質譜聯用（UHPLC-ESI-Q-TOF MS）研究燈盞細辛提取物中的入血成分。[方法]首先采用傳統中藥煎煮方法，制備燈盞細辛提取物；然后收集健康SD大鼠的含藥血漿，分別用甲酸水溶液和甲醇處理樣品后，采用UHPLC-ESI-Q-TOF MS并結合對照品，質譜碎片信息和相關文獻，初步推測燈盞細辛提取物的血漿移行成分。[結果]通過與對照品比對并分析相關檢測數據，在含藥血漿中檢測到綠原酸、燈盞乙素、燈盞乙素苷元和燈盞甲素4種原型成分。[結論]該研究初步明確了燈盞細辛提取物可被吸收的物質基礎，可為該藥在大鼠體內的藥代動力學研究提供依據。

關鍵詞 燈盞細辛提取物；血漿移行成分；UHPLC-ESI-Q-TOF MS

中圖分類號 S567；R284.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）02-0155-05

Abstract [Objective] The research aimed to study the ingredients of Erigeron breviscapus extract into the plasma of rats by UHPLCESIQTOF MS.[Method]Firstly，Erigeron breviscapus extract were prepared by the method of the traditional Chinese medicine decoction.Then，the plasma of healthy SD rats was collected and the samples were treated with formic acid aqueous solution and methanol respectively.Identification of ingredients of Erigeron breviscapus extract into the plasma of rats were performed by comparing the changes in molecular masses，retention times and full scan metabolisms （MS） spectra with those of the parent drug，and the relative data of authentic reference.[Result]Four prototype components of chlorogenic acid，scutellarin，scutellarin and apigenin7Oglucronide were detected in the drugcontaining plasma by comparing with the reference substance and analyzing the related test data.[Conclusion]The study initially identifies the material basis for the absorption of Erigeron breviscapus，which laid the basis for studying its pharmacokinetic in rats.

Key words Erigeron breviscapus extract；Plasma migration ingredients；UHPLCESIQTOF MS

燈盞細辛，又名燈盞花、細藥、踏地蓮花菜等，其因花似燈盞、根似細辛得名，為菊科植物短葶飛蓬[Erigeron breviscapus （Vant.） Hand.-Mazz.]的干燥全草[1-2]，主要分布于貴州、云南等地。《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》稱該品“辛溫，具有活絡止痛、祛風除濕、散寒解表的功效，主治中風偏癱、胸痹心痛等病癥，為貴州省少數民族用藥”。2015版《中國藥典》一部也予以記載[3]。研究發現，燈盞細辛中的黃酮和咖啡酸酯類化合物是其特征性成分，也是治療腦血管疾病的活性成分[4]。但在對中藥的復雜成分研究中，很多成分體外有活性，體內卻不能被吸收或入血前被代謝而未發揮體內藥效。因此，首先確定中藥的體內直接作用物質才能為后續的藥物體內過程、作用機制和生物轉化等研究提供理論參考。

筆者依據傳統中藥煎煮方法，對燈盞細辛進行水煮濃縮簡單提取，最大限度地保留原藥材中有效物質；然后運用

超高效液相色譜-電噴霧-四級桿-飛行時間串聯質譜聯用（UHPLC-ESI-Q-TOF MS）對燈盞細辛提取物藥液以及含藥血漿進行分析，通過與對照品比對并分析相關檢測數據，獲得試驗大鼠口服燈盞細辛提取物后的血漿移行成分，明確燈盞細辛提取物可被吸收的藥效物質基礎，為該藥在大鼠體內的藥代動力學研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設備。

UHPLC-Q-TOF（Agilent UHPLC系統，包括二元高壓梯度泵、自動進樣器，二極管陣列檢測器；Bruker MicroTOF-Q Ⅱ高分辨質譜儀，配有電噴霧電離源，Compass1.2工作站）；真空玻璃干燥器（濟寧宏明化學試劑有限公司）；SHB-Ⅲ 循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；Water purifier實驗室專用超純水機（沃特爾水處理設備有限公司）；Allegra 64R低溫高速離心機（美國Beckman Coulter公司）。

1.1.2 主要材料。燈盞乙素對照品（批號 MUST-15042811，純度≥98%，北京恒元啟天化工技術研究院）；燈盞甲素對照品（批號 D07-130912，純度≥98%，中國固體制劑制造技術國家工程研究中心）；燈盞乙素苷元對照品（批號 MUST-15032012，純度≥98%，北京恒元啟天化工技術研究院）；綠原酸對照品（批號 MUST -15042802，純度≥98%，北京恒天啟天化工技術研究院）；甲酸（色譜純，德國Merck公司）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏有限公司）。

燈盞細辛藥材購自云南省燈盞細辛藥材種植基地，由貴州醫科大學藥學院藥用植物學與生藥學教研室龍慶德副教授鑒定為菊科植物短亭飛蓬[Erigenrm breviscapus（Vant.） Hand.-Mazz.]的干燥全草。

1.1.3 試驗動物。健康SD大鼠，雄性，體重為（280± 20）g，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供，為清潔級動物，動物許可證號SCXK（渝）2012-0008。

飼養條件：購入的大鼠進入動物室后，按每籠5只分裝。由專人飼養管理，以標準飼料喂養并每日更換新鮮純凈水。動物室光照充足，通風良好，室溫18～25 ℃，相對濕度50%～70%，動物飼養室按常規定期消毒。

1.2 方法

1.2.1 燈盞細辛提取物的制備。

依據傳統中藥煎煮方法，將燈盞細辛全草去泥，分別用10倍水煎煮3次，過濾并合并濾液，濃縮至浸膏狀，進行微波真空干燥，將干燥物粉碎，即獲得燈盞細辛提取物。

1.2.2 液相條件。

Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速為0.30 mL/min；柱溫為40 ℃，流動相為0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），進樣體積為1 μL。梯度洗脫條件：0～11 min，4%～35%（A）；11～16 min，35%～5%（A）；16～17 min，5%～0（A）；17～18 min，0～4%（A）。

1.2.3 質譜條件。電噴霧離子源（ESI），掃描方式為正負離子掃描（ESI-和ESI+，m/z 50～1 000），毛細管電壓3 kV，錐孔電壓80 V，離子源溫度110 ℃，霧化氣（N2）壓力1.2 bar，流速8.0 L/min，溫度200 ℃，脫溶劑氣溫度300 ℃，氣體體積流量50 L/h，脫溶劑氣體積流量550 L/h，準確質量測定采用甲酸鈉校正標準液，校正模式選用Enhanced Quadratic。質譜數據采集及處理軟件為Compass 1.2。

1.2.4 標準溶液的配制。

精密稱取綠原酸10.08 mg、燈盞乙素9.51 mg、燈盞乙素苷元7.88 mg、燈盞甲素10.58 mg，用甲醇定容至10 mL，獲得綠原酸1.008 mg/mL、燈盞乙素0.951 mg/mL、燈盞乙素苷元0.788 mg/mL、燈盞甲素1.058 mg/mL的儲備液。分別精密量取綠原酸等4種對照品儲備液適量，用甲醇按梯度稀釋成所需濃度，得混合系列標準溶液，置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.5 血漿樣品收集。

選取健康SD大鼠，通過灌胃給予燈盞細辛提取物溶液，給藥劑量為10 g/kg（按生藥量計算），給藥前24 h禁食，自由飲水。給藥30 min后通過股動脈取血，將全血置涂有肝素鈉的塑料離心管中，離心（4 500 r/min，3 min），分離血漿，并置于-20 ℃冰箱中保存，直至分析。

1.2.6 血漿樣品處理方法。

取大鼠血漿1 mL，置于10 mL塑料離心管中，依次加入50 μL 1%甲酸，4 mL甲醇，手動搖勻，超聲（10 min），離心（10 000 r/min，10 min），取上清液置于10 mL離心管，37 ℃下氮氣吹干；再加1 mL甲醇，渦混，超聲（10 min），將溶液轉移至2 mL塑料離心管中，離心（12 000 r/min，5 min），取上清液置離心管中，37 ℃下氮氣吹干；最后用300 μL初始流動相溶解，UHPLC-ESI-Q-TOF MS進樣分析。

2 結果與分析

2.1 燈盞細辛提取物的制備

制備的燈盞細辛提取物為棕褐色粉末狀，該提取物容易吸潮，需放置于真空玻璃干燥器中備用。該工藝的固形成分提取率達36%。

2.2 燈盞細辛提取物中入血成分的確認

該試驗采用內標校正法分別在正負兩種模式下進行檢測分析，比較空白溶液、混合對照品溶液、燈盞細辛提取物溶液和含藥血漿的提取離子流色譜圖。從圖1～2可以看出，各成分間分離度良好，無明顯基質干擾，且基線平穩。

在相同色譜條件的負離子模式下，混合對照品溶液的色譜圖中綠原酸、燈盞乙素、燈盞甲素和燈盞乙素苷元分別在4.3、7.5、8.3和9.3 min出峰，而在燈盞細辛提取物和含藥血漿的色譜圖中相應時間點也能檢測到4個成分（圖1）。通過進一步獲取4個成分的高分辨質譜棒狀圖（圖3），以及各成分的高分辨數據（表1），結果顯示，含藥血漿、燈盞細辛提取物中各成分與對照品中已知化合物的出峰時間、離子碎片保持一致，并且各成分的質量精度均在5 ppm以內，提示檢測結果在可信度范圍內。

在相同色譜條件的正離子模式下，混合對照品溶液的色譜圖中綠原酸、燈盞乙素、燈盞甲素和燈盞乙素苷元也分別在4.3、7.5、8.3和9.3 min出峰，而在燈盞細辛提取物色譜圖的相應時間點也能檢測到4個成分（圖2）。由于綠原酸偏酸性，屬于質子的給予體，導致其在正模式下的響應較負模式下偏低，以致于在含藥血漿的色譜圖中幾乎檢測不到綠原酸，而其余成分在相應保留時間點能夠檢測到。進一步獲取各個成分的高分辨質譜棒狀圖（圖4）和高分辨數據（表2），結果顯示，含藥血漿（除綠原酸以外）、燈盞細辛提取物中各成分與對照品中已知化合物的出峰時間、離子碎片保持一致，并且各成分的質量精度均在5 ppm以內，提示檢測結果在可信度范圍內。

3 討論

3.1 燈盞細辛提取方法的選擇

近年來的研究證實，中藥防治疾病的物質基礎是多成分協同作用的綜合結果[5-6]。中藥材成分復雜，而在現代的中藥研究中，常常將原藥材進行不同程度的提取精制，獲得特定的有效組分或單體后再進行研究，這種研究思路使得目標成分較明確，但也不同程度地導致其他有效成分的流失。關于燈盞細辛的炮制或服用方法在《滇南本草》《中國藥典》等藥材典籍中均記載為“以水煎服”。因此，該試驗依據傳統中藥煎煮方法，對燈盞細辛進行水煮濃縮簡單提取。該方法既符合中藥傳統用藥習慣，又最大限度地保留了原藥材中的有效物質。

3.2 入血成分試驗方法的選擇

血清藥物化學是近年迅速發展起來的研究中藥藥效物質基礎較為科學的一種方法。該方法能夠防止中藥粗制劑或提取物本身理化性質對試驗干擾，通過模擬藥物體內過程，實現體外試驗的有效性，避免了直接體外試驗可能得出的錯誤結論[7]。因此，該試驗選擇研究血漿中燈盞細辛提取物的原型成分，主要是為后續的藥代動力學試驗提供理論依據。

3.3 血漿移行成分

該研究采用水煮濃縮法制備燈盞細辛提

取物，通過灌胃給予大鼠提取物后，能夠在其血漿中檢測綠原酸、燈盞乙素、燈盞乙素苷元以及燈盞甲素4個原型成分。結合文獻報道[8]，以上成分均具有清除自由基、抗氧化損傷的活性，提示綠原酸等4個化合物是燈盞細辛提取物中可被吸收的藥效物質。

參考文獻

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[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：化學工業出版社，2015：147-148.

[4] 唐浩.燈盞乙素苷元抗腦缺血作用研究以及代謝穩定衍生物的合成[D].南京：南京中醫藥大學，2014.

[5] 趙靜，梁愛華.Caco2細胞模型及其在中藥吸收轉運研究中的應用[J].中國實驗方劑學雜志，2009，15（5）：79-83.

[6] 胡杰，侯佳，李月婷，等.燈盞細辛提取物中3種活性成分在Caco-2細胞模型吸收機制的研究[J].中國藥理學通報，2016，32（3）：373-377.

[7] 肖秋元，馬超英.血清藥物化學在中藥物質基礎方面的研究進展[J].時珍國醫國藥，2009，20（5）：1061-1062.

[8] 黨翠芝，黃小燕，楊慶雄，等.燈盞細辛的抗氧化活性研究[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（17）：100-103.