毛木耳958對4種抗生素的敏感性研究

杜春梅 柏廣波 董錫文

摘要 [目的]檢測毛木耳958對青霉素、硫酸鏈霉素、制霉菌素和卡那霉素 4 種抗生素的敏感性，以尋找適合原生質體融合育種的抗性篩選標記。[方法]以毛木耳958為試驗材料，在PDA培養基中加入不同濃度的抗生素，測定菌絲生長速率、菌落形態特征和鎖狀聯合菌絲數量。[結果]適宜濃度的青霉素和硫酸鏈霉素對毛木耳958菌絲生長都有顯著的促進作用，而制霉菌素和高濃度的卡那霉素對菌絲生長有明顯的抑制作用；4 種抗生素對毛木耳958菌落形態特征影響較小；青霉素、制霉菌素和卡那霉素高于 300 μg/mL 時，毛木耳958鎖狀聯合菌絲比率呈明顯的下降趨勢，硫酸鏈霉素對其無顯著作用。[結論]毛木耳958對制霉菌素和高濃度的卡那霉素具有較強的敏感性，做篩選標記時控制好抗生素的濃度，盡量減少其對鎖狀聯合菌絲比率的影響。

關鍵詞 毛木耳958；抗生素；敏感性；菌絲；鎖狀聯合

中圖分類號 S646.6 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）23-0033-02

Abstract [Objective] To study the sensitivity of Auricularia polytricha 958 to penicillin，streptomycin sulfate，nystatin and kanamycin，as well as to find the resistance screening markers suitable for protoplast fusion breeding.[Method] Taking Auricularia polytricha 958 as the material，growth rate of mycelia，morphological features of colony and clamp connection amount of mycelia were determined by adding different concentrations of four kinds of antibiotics in PDA media.[Result] Growth rate of mycelia were promoted significantly by a proper concentration of ampicillin and streptomycin sulfate.But growth rate of mycelia were inhibited significantly by nystatin and the higher concentration of kanamycin.The effects of four antibiotics on the colonial morphological characteristics of the stain were not significantly.The ratios of hyphal clamp connection of Auricularia polytricha 958 were decreased when the concentration of penicillin，nystatin and kanamycin were higher than 300 μg/mL.The effect of streptomycin sulphate on forming of clamp connection was not significant.[Conclusion] The sensitivities of Auricularia polytricha 958 to nystatin and the higher concentration of kanamycin were obvious.Thus，the concentration of antibiotics should be controlled when it was used to screening marker，and minimize the effect of the antibiotic on ratio of hyphal clamp connection.

Key words Auricularia polytricha 958；Antibiotics；Sensitivity；Mycelia；Clamp connection

毛木耳屬于木耳目，木耳科，木耳屬中的毛木耳種（Auricularia polytricha）[1]，是世界性的重要栽培品種之一，主要生長在中國的南方和一些東南亞國家[2-3]。毛木耳含有豐富的鎂元素，其抗逆性強、產量高、價格低廉，但品性差、質地硬而脆[4-5]。對毛木耳和嫩滑、味好、鐵元素含量較高、商品性好的黑木耳進行原生質體融合，有可能篩選出具有雙親優良性狀的木耳新種。但利用哪種篩選標記來篩選融合子是育種工作者面臨的瓶頸。抗藥性標記是篩選融合子的較好手段，微生物抗藥性由菌種遺傳物質決定，遺傳上十分穩定[6]。用抗藥性差異選擇融合子時要把握好藥物的濃度，過高或過低都會影響融合子的檢出。毛木耳958是山東省廣泛栽培的一個毛木耳品種，其出耳溫度20～36 ℃，具有極強的抗霉能力，耳片大且肉厚，總產量高，用純玉米心種植0.5 kg干料可以產出干耳90～125 g，是用于融合育種的重要備選菌種之一。鑒于此，筆者初步測定了毛木耳958對4種不同濃度梯度抗生素的敏感性，以期找到合適的遺傳篩選標記，為木耳的原生質體融合育種研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。毛木耳958斜面菌種購于山東省濟寧市永騰食用菌研究所。

1.1.2 培養基。PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g，水1 000 mL，pH 5.8[7]。

抗生素-PDA培養基：在PDA培養基中加入不同濃度抗生素，包括青霉素-PDA培養基，硫酸鏈霉素-PDA培養基，制霉菌素-PDA培養基和卡那霉素-PDA培養基等。

1.1.3 試劑。青霉素（80萬單位，國藥準字H31020929，華北制藥股份有限公司），硫酸鏈霉素（10萬單位，國藥準字H37022586，瑞陽制藥有限公司），制霉菌素片（50萬單位，國藥準字H330211393，浙江震元制藥有限公司），卡那霉素（20萬單位，國藥準字H37020562，齊魯制藥有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 抗生素母液的配制。

將4種抗生素制備成50 mg/mL抗生素母液，用0.45 μm微孔濾膜進行過濾除菌后于4 ℃冰箱儲存備用。

1.2.2 培養基的制備。

PDA培養基按常規方法制備。抗生素-PDA培養基是在PDA培養基中加入不同體積的抗生素母液，使其終濃度分別為50、100、200、300、400和500 μg/mL。

1.2.3 菌種的活化及接種。

將供試斜面菌種放入25 ℃的培養箱中活化培養24 h后，用接種鏟接種到PDA平板上進行擴大培養8 d。在菌落周邊取直徑為0.65 cm健壯的菌絲塊，用接種鏟轉接到制備好的抗生素-PDA培養基平板中央。同時用鑷子夾取潔凈的已滅菌的蓋玻片傾斜45°插入培養基中，蓋玻片距離接種塊2 cm，每個平板插入3個蓋玻片，置于25 ℃培養箱中避光培養。每個變量設6個重復，其中3個重復觀察菌絲體生長速率及外觀特征，另外3個重復用于顯微鏡下觀察，以上均以無抗生素的PDA培養基作空白對照。

1.3 觀察及測定

1.3.1 菌絲體外觀特征。

每天用游標卡尺測量培養中的毛木耳958的菌落直徑，連續測量9 d，計算平均日長速及抑制率。菌絲平均日長速（cm/d）=（菌落直徑-接種塊直徑）/（2×天數）。抑制率（%）=[（對照菌絲生長速率-抗生素處理菌絲生長速率）/對照菌絲生長速率]×100[8]。同時觀察菌絲組織外觀特征，包括萌發時間，菌絲色澤、密度、長勢，菌落邊緣，褐變程度，隆起狀況等。

1.3.2 顯微觀察。

待毛木耳958菌絲長滿蓋玻片，在無菌操作臺內取出，置于10×40倍顯微鏡下觀察記錄菌絲鎖狀聯合形成情況，計算鎖狀聯合菌絲比率。菌絲鎖狀聯合比率=鎖狀聯合個數/菌絲數[9]。

1.4 數據分析

試驗數據用SPSS 17.0進行統計分析，用Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同抗生素培養基對毛木耳958菌絲平均日長速的影響

由表1可知，在試驗濃度范圍內，青霉素對毛木耳958菌絲生長具有顯著促進作用（P<0.05）。隨著青霉素濃度的升高，促進作用先強后弱。當青霉素濃度為100 μg/mL時，促進作用最強，生長速率與對照相比提高了13.00%；濃度為100～300 μg/mL時，硫酸鏈霉素對毛木耳958的生長促進作用最強且無差異顯著性（P>0.05）；濃度大于300 μg/mL時，出現了明顯的抑制作用，但抑制率不超過5%；制霉菌素對毛木耳958有明顯的抑制作用，并且濃度越高抑制作用越強，抑制率高達40%；濃度在300 μg/mL范圍內，卡那霉素對毛木耳958的生長影響不顯著，高于此濃度開始出現抑制作用，且抑制作用顯著增強。

2.2 不同抗生素培養基對毛木耳958菌落形態特征的影響

在試驗濃度范圍內，各培養基培養的毛木耳958菌絲的萌發時間大多數為48 h。含青霉素和制霉菌素的PDA培養基培養的菌絲體外觀形態特征與對照菌株相比無顯著變化，但色素產量略有增加；硫酸鏈霉素-PDA培養基上菌絲體較稀疏，色素產量較對照菌株有顯著增加；卡那霉素-PDA培養基上菌絲體較稀疏，其他特征無明顯區別。

2.3 不同抗生素培養基對毛木耳958鎖狀聯合菌絲比率的影響

從圖1可以看出，隨著硫酸鏈霉素濃度的升高，毛木耳958鎖狀聯合菌絲比率不顯著的增加趨勢（P>0.05）；青霉素、制霉菌素和卡那霉素在低濃度時，該比率略高于不加抗生素培養的對照菌株，且差異不顯著。高于300 μg/mL時，該比率呈明顯的下降趨勢（P<0.05）。

3 結論與討論

自從1972年Devriers等人對裂褶菌原生質體制備成功開始，原生質體融合技術已運用到食用菌研究領域[10]。原生質體融合育種遺傳信息傳遞量大，不需詳細了解雙親的遺傳背景，可實現遠緣雜交；該方法操作方便，適用性強，為食用菌新種的選育提供了廣闊的發展前景[11]。

近年來，融合子篩選方法不斷涌現，如利用抗藥性選擇融合子，馬玉銀等[12]采用一定濃度的NaNO3選擇再生培養基對佛羅里達側耳與姬菇融合后代進行篩選得到一株雙親融合菌株。王淑珍等[13]利用食用菌對潮霉素的自然抗性篩選香菇和松茸的融合子。用抗藥性差異選擇融合子時要控制藥物的濃度，濃度過低則親本生長過快，影響融合子的檢出；濃度過高則融合頻率降低[6]。該研究結果顯示，一定濃度的青霉素和硫酸鏈霉素對毛木耳958菌絲生長有明顯的促進作用，菌落外觀特征與對照菌株相比沒有發生明顯的變化；在試驗濃度范圍內，毛木耳958對制霉菌素和高濃度的卡那霉素有極強的敏感性，菌絲生長受到顯著抑制，這與筆者前期對黑木耳的研究結果類似[14]。鎖狀聯合是黑木耳菌絲生長發育過程中明顯的指示特征，可作為自然遺傳標記。肖在勤等[15]利用雙親都具有鎖狀聯合的雙核異核菌絲體為親本，進行鳳尾菇與金針菇科間的原生質體融合，并結合融合核分裂技術篩選融合子。該研究結果顯示，青霉素、制霉菌素和卡那霉素高于300 μg/mL時，都能顯著降低鎖狀聯合菌絲的比率。經統計學分析顯示，菌絲日生長速率與鎖狀聯合菌絲比率之間呈極顯著的正相關性。由此可以得出，制霉菌素或高濃度的卡那霉素能抑制毛木耳958的生長速率，可考慮作為育種的抗性篩選標記，但做篩選標記時應控制好抗生素的濃度，盡量減少其對鎖狀聯合菌絲比率的影響。

參考文獻

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