柞蠶核型多角體病毒基因組編碼的VmiRNA篩選及功能分析

劉丹梅 宋麗新 李文利

摘要 [目的]VmiRNA不僅可以控制自身基因，還可調節宿主的穩定表達，研究VmiRNA的功能有助于從分子水平說明核型多角體病毒與柞蠶的寄生關系，從而改進對病毒的防控措施。[方法]利用生物信息學及實時定量PCR等分子生物學相關技術，對柞蠶核型多角體病毒編碼的miRNA及其作用的靶標基因進行研究。[結果]經預測和篩選得到了ApNPV編碼的miRNA MD217，與其有關的宿主靶基因14種，主要參與細胞組成、生化過程以及分子功能等途徑，涉及到生物體細胞內一些催化、免疫反應等過程；實時定量PCR結果表明，MD217在病毒感染后上調表達，脂肪體組織內的靶基因MAPKK7表達水平與MD217的表達呈正相關。[結論]miRNA MD217在病毒感染后誘導表達，推測很可能降低了宿主免疫系統的防御能力，并同時影響靶基因MAPKK7的功能表達，從而避免了在免疫應答過程中的免疫清除。

關鍵詞 柞蠶；核型多角體病毒；miRNA；靶標基因

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）23-0065-04

Abstract [Objective] VmiRNA can not only control its own gene，but also regulate the stable expression of the host.Studying the functions of VmiRNA can help to explain the parasitic relation between nuclear polyhedrosis virus and Antheraea pernyi on molecular level，thus improving preventions and controls of the virus.[Method] In this study，molecular biological techniques such as bioinformatics and Quantitative Realtime PCR were employed to research the miRNA of Antheraea pernyi nuclear polyhedrosis virus and its target gene.[Result] The miRNA MD217，which was encoded by ApNPV，was obtained by predicting and screening.The analysis showed that there were 14 host target genes related to MD217，and they were mainly involved in cell composition，biochemical processes，molecular functions and so on.They also referred to some processes in biological cells，such as catalysis and immunoreaction.The results of the Quantitative Realtime PCR showed that after the virus infection，MD217 upregulated the expression，and its expression was positively corrlated with the target gene MAPKK7 in adipose tissue.[Conclusion] The expression of miRNA MD217 was induced by virus infection.It was speculated to decrease the defense ability of the host immune system and affect the functional expression of the target gene MAPKK7 at the same time，thus avoiding the immune clearance in the immune response.

Key words Antheraea pernyi；Nuclear polyhedrosis virus；miRNA；Target gene

柞蠶核型多角體病毒（ApNPV）是柞蠶膿病的病原微生物[1]，屬桿狀病毒科包含體桿狀病毒亞科，核型多角體病毒屬。桿狀病毒是桿狀的包膜病毒，具有環狀雙鏈DNA，長度為80～18 000 kb，這些病毒感染了超過600個寄主物種，主要寄生于節肢動物中的鱗翅目、膜翅目和雙翅目昆蟲中[2]。桿狀病毒與宿主細胞相互作用機理研究，包括在病毒進入和結合時的相互作用，宿主基因表達調節，以及修飾與調節細胞和機體所發生的生理和防御的相互作用的復雜和微妙的機制等[3]。

MicroRNA簡稱miRNA，是真核生物中非編碼的內源性小分子RNA，是由莖環結構前體物質在核內經過一系列核酸酶的剪切運輸到核外加工成熟形成的[4-5]，其本身不參與蛋白質的編碼[6]，但卻參與剪切、降解、抑制翻譯以及染色體修飾等生物過程[7]。miRNA通過與靶標的結合程度不同來實現調控功能[8]，當miRNA與其靶標完全或近乎完全互補時，會引起mRNA降解而降低其表達；當兩者不完全互補時，主要通過抑制靶標mRNA的翻譯起作用[9]。

目前關于

核型多角體病毒編碼miRNA的研究還較少。2011年，陳蔚等[10]利用Vmir軟件成功地預測5條家蠶核型多角體病毒（BmNPV）編碼的miRNA成熟體序列，經試驗分析得到6條成熟體序列，推測其可能參與并調節了病毒感染宿主的過程，但未進行試驗驗證。Zhang等[11]利用miRNA的調控機理，構建了以BmNPV基因lef-1為靶基因的人工miRNA表達系統，成功利用RNA干擾技術產生了具有抑制病毒復制并降低病毒感染的成熟amiR2764和amiR279。李文利等[12]于2013年利用建立的柞蠶基因轉錄組數據庫和基因組GSS數據庫，在研究柞蠶核型多角體病毒編碼的miRNA靶基因時發現135個與柞蠶免疫相關的基因，研究表明這些基因主要參與免疫系統的發育、免疫應答和免疫調節等過程。

筆者通過生物信息學方法和分子生物學相關技術，對ApNPV編碼的miRNA進行篩選，并對VmiRNA的靶標基因進行預測；通過靶標基因功能分析及實時定量PCR驗證，期望明確ApNPV與宿主miRNA之間的關系，并為柞蠶膿病的防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 柞蠶青6滯育蛹、柞蠶核型多角體病毒均由大連理工大學生命科學與技術學院實驗室提供。

1.2 miRNA的前體預測

采用VMir Analyzer（version 2.3）軟件進行miRNA的前體預測。首先將ApNPV基因組（GenBank登錄號：NC_008035）導入VMir軟件中，設定序列最低得分150，最低窗口值35為條件初步篩選出病毒基因組編碼的miRNA前體序列。在RNAshapes軟件中得到前體序列的二級結構，并利用RNAhybrid分析這些序列的最小折疊自由能等參數，預測候選的miRNA。依據保守性區域的變化、5端首個堿基U存在等條件，利用Mireap得到預測的成熟體序列。

1.3 miRNA的靶基因預測與功能分析

采用RNAhybrid在線預測軟件（http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybridwelcome.htlm）預測miRNA靶基因。在軟件的窗口中輸入miRNA序列和柞蠶cDNA文庫的序列，經過分析得到相關的靶基因。將預測得到的miRNA靶標基因序列導入Blastx中，與NCBI蛋白質數據庫已經收錄的蛋白質序列進行比對得到序列相似性較高的蛋白質序列，并根據該已知蛋白質的功能注釋分析靶標基因的功能，從而得到靶基因的功能信息，并對靶基因進行分類。

1.4 柞蠶脂肪體總RNA提取及cDNA合成

將ApNPV接種在柞蠶蛹脂肪體內，收集已發病的脂肪體組織，放入液氮中研成粉末，參照miRNeasy Mini Kit試劑盒（TaKaRa公司）說明書進行柞蠶脂肪體總RNA的提取，于-70 ℃保存備用。

利用PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒（TaKaRa公司）進行反轉錄生成cDNA，過程參照說明書進行。

1.5 預測得到的前體序列的檢測

利用前體序列設計上下游引物，以脂肪體總RNA反轉錄合成的cDNA為模板，5s rRNA為內參，進行反轉錄PCR檢測。反應條件如下：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共30個循環。

將PCR電泳條帶回收，制備陽性克隆并進行基因測序，將預測的序列信息與測序結果進行比對。

1.6 miRNA的表達分析

根據預測所得miRNA MD217序列設計上游引物（F-5′-TTGTGCTTGAAAAACGTAATCTATT-3′）；以SYBR primeScript miRNA RT-PCR kit 試劑盒的通用引物為下游引物（R-5′-GTTTTTCAAGAATGGCTGTACTCGA-3′），以柞蠶蛹脂肪體總RNA反轉錄的cDNA為模板，利用TP900實時熒光定量PCR儀，進行實時定量分析。

1.7 VmiRNA靶基因表達分析

根據預測得到的靶基因MAPKK7序列設計引物（F-5′-TGCTTCCGAGAAACGTAAGG-3′；R-5′-GTTCTTGTTCCTGATGTGGATTT-3′），以柞蠶蛹脂肪體總RNA反轉錄生成的cDNA為模板，以β-Actin 作為內參，進行實時定量PCR檢測，反應條件：95 ℃變性30 s；95 ℃退火5 s；60 ℃延伸30 s，共40個循環，每組數據重復3次。并與miRNA的實時定量PCR結果進行同步對比。

2 結果與分析

2.1 預測得到的VmiRNA前體序列及其二級結構特征 在Vmir Viewer中設置發夾結構大于150 nt，長度70～165 bp，得到正鏈上的5個VmiRNA。應用RNAfold分析這些VmiRNA分子前體序列二級結構，這些預測得到的二級結構均含有莖環結構，最小折疊自由能為-23～-60 kJ/mol的有3個VmiRNA，平均值為-33.97 kJ/mol（表1）。

通過與測序結果進行對比分析，利用RNAshapes得到VmiRNA的二級結構，主要依據二級結構不同區域序列保守性的變化、5′端首個堿基U的存在、內部環和泡狀區域的對稱性、miRNA序列與末端環之間（2～9 nt）的保守性互補堿基對等篩選出VmiRNA MD217（圖1），并利用MD217進行后續試驗。

2.2 miRNA前體序列MD217的鑒定

以預測得到的MD217前體序列及成熟體序列為基礎設計引物，對已經被ApNPV感染的柞蠶脂肪體組織的RNA進行PCR擴增。在2%瓊脂糖凝膠電泳中鑒定PCR產物，得到與預測的VmiRNA前體MD217分子量相符合的條帶（圖2）。將回收產物測序，經過與ApNPV基因組序列比對，得到的結果一致，推測這條序列就是ApNPV編碼的VmiRNA MD217前體序列。

2.3 VmiRNA MD217的靶標基因預測及表達分析

運用RNAhybrid軟件對成熟VmiRNA MD217的宿主靶標基因進行預測，結果找到多個靶標基因，這些靶標基因主要有14種（圖3），分為細胞組成、細胞過程等方面，參與細胞內免疫系統、分析結合、酶催化反應等過程。其中，與免疫系統相關的有6個（表2），主要參與免疫調節、免疫應答等過程。

利用實時定量PCR的相對定量法分析預測得到的MD217成熟體及靶基因MAPKK7的表達情況（圖4）。由圖4可以看出，miRNA MD217在感染ApNPV后3 h表達量明顯上升到最高，達25.06，而到了6 h時明顯下降，并隨著時間增加而逐漸減低；靶基因的表達水平與MD217的表達呈正相關。說明MD217在病毒感染后上調表達，作用于宿主靶基因后，miRNA上調了靶基因的表達，當miRNA水平提高時，靶基因水平也提高，隨著miRNA水平的降低，靶基因的表達水平也降低了。

3 討論

病毒miRNA（VmiRNA）是近年來被發現的一類由病毒及其宿主共同產生的分子，現在已經發現了超過200個VmiRNA。研究表明，病毒利用這些miRNA控制細胞和病毒基因的表達，病毒性感染對細胞miRNA表達譜有重要影響，而miRNA也可以增強它們的復制潛力[13]。

該研究通過Vmir預測篩選獲得了ApNPV基因組編碼的miRNA MD217前體序列，經過一系列試驗驗證結果與預期符合；對MD217成熟體序列及其作用的宿主靶標基因進行了功能預測，利用實時定量PCR實時監測MD217和其靶標基因MAPKK7的表達水平，通過Ct差值法對相對表達量進行了分析，結果顯示在3 h后MD217的相對表達量隨時間增加而逐漸降低。miRNA MD217在病毒感染后誘導表達，很可能是降低了宿主免疫系統的防御能力，并同時影響靶基因MAPKK7的功能表達，從而避免了在免疫應答過程中的免疫清除。

促絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯途徑是一類在真核生物中廣泛存在的重要的信號傳導網絡。經典的 MAPK 級聯途徑包括3個必需的激酶組分：MAPKKK、MAPKK和 MAPK，通過順序磷酸化而發揮功能[14]。李國奇等[15]認為，MAPK信號傳導通路是廣泛存在于哺乳動物及植物體內的重要信號傳導系統，其接受多種多樣的生物刺激，通過多級級聯式傳導程序引發細胞的生長、繁殖、分裂、凋亡等生理過程，同時參與炎癥、腫瘤等病理過程。他們的研究表明，MAPKK7 是腫瘤發生、發展與轉移的抑制因素，關于MAPKK7 的進一步研究很可能推導出新的腫瘤診治措施。虞朝輝[16]運用miRNA表達譜技術對小鼠肝臟缺血的研究表明，miR-370可能通過影響潛在靶標基因MAPKK3和MAPKK7的表達，進一步調節MAPK信號傳導通路的信號分子，由此在肝臟I/R損傷和IPC中發揮調節作用。筆者在ApNPV上取得的數據與MAPK在植物和人體上的結論有相關性，同時也將豐富MAPK信號傳導網絡的研究。

越來越多的研究表明，miRNA參與對病毒侵染免疫反應的調控過程。不同昆蟲及細胞感染不同病毒后，其miRNA表達譜多會發生顯著變化，如棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）幼蟲[17]和草地貪夜蛾Sf9細胞[18]感染桿狀病毒、家蠶幼蟲感染質型多角體病毒（BmCPV）[19-20]等，它們miRNA表達譜的變化可能來自寄主本身的抗病毒反應，亦可能受病毒基因的調控而產生。

綜上所述，病毒除了通過自身的一些基因與宿主發生相互作用外，亦可通過編碼一些VmiRNA與宿主發生相互作用，通過VmiRNA調節宿主體內某些相關基因以及自身相關基因的表達，為病毒在宿主內的存在創造有利的生存環境。隨著對ApNPV和miRNA的進一步探索，將全面地了解柞蠶和ApNPV之間的作用關系，并以此制訂更好的柞蠶膿病防御措施。

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