沙田柚生長素響應基因SAUR的鑒定及序列分析

陳玉梅 李璐璐 徐媛

摘要[目的]研究沙田柚生長素響應基因SAUR基因編碼的蛋白質序列所包含的生物信息學。[方法]以沙田柚自交和異交花柱為材料，通過高通量測序技術進行轉錄組測序，在差異表達基因中鑒定出SAUR基因。[結果]該基因全長857 bp（登錄號為MH281940），開放閱讀框（ORF）為381 bp，編碼126個氨基酸，編碼的蛋白質理論等電點為5.76，相對分子質量為13.74 kD，含有1個與Auxin_inducible superfamily蛋白相同的保守結構域。沙田柚SAUR基因在自交1～3 d花柱中的表達量（RPKM）分別為8.42、56.02、53.45；而在異交1～3 d花柱中的表達量分別為11.98、36.74、8.53。氨基酸序列分析表明，該基因編碼的氨基酸與克萊門柚和甜橙SAUR基因編碼的氨基酸的同源性分別為100%、99%。系統進化樹顯示，沙田柚SAUR基因與克萊門柚和甜橙的親緣關系很近，屬同一進化分支。[結論]研究結果可為今后深入研究沙田柚自交不親和機理提供參考。

關鍵詞 沙田柚；自交不親和；SAUR基因；序列分析

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）22-0081-04

Abstract[Objective]To study the biological information contained in the protein sequence encoded small auxin up RNA（SAUR）gene.[Method]The selfpollinated and crosspollinated style of Citrus grandis var.Shatinyu Hort were used as test materials and transcriptome sequenced by highthroughput sequencing technology.The SAUR gene was identified in diferentially expressed genes.[Result]The gene was 857 bp（GenBank accession number：MH281940）in length with an open reading frame（ORF） of 381 bp，encoding 126 amino acids with theoretical pI value of 5.76，and deduced molecular weight of 13.74 kD，and contained a Auxin_inducible superfamily conserved domain.The expression（RPKM） of SAUR gene was 8.42，56.02 and 53.45 respectively in 1，2，3 days in selfpollinated styles，and the expression（RPKM） of the gene was 11.98，36.74 and 8.53 respectively in 1，2，3 days in crosspollinated styles.The homology analysis of amino acid sequence indicated that the SAUR protein shared 100% homology with Citrus clementina（XP_006452877.1）and 99% homology with Citrus sinensis（XP_006474595.1）.Phylogenetic analysis revealed that SAUR gene showed closer kinship with Citrus clementina and Citrus sinensis， indicating that they belong to the same evolutionary branch.[Conclution]The results could provide a theoretical reference for further study of selfincompatibility molecular mechanism in Citrus grandis var.Shatinyu Hort.

Key words Citrus grandis var.Shatinyu Hort；Selfincompatibility； SAUR gene；Sequence analysis

在配子體自交不親和性（gametophytic selfincompatibility，GSI）植物中，花粉管生長在花柱中受到抑制，不能順利完成受精作用[1]。研究發現，GSI受S位點的基因控制。在玄參科西班牙金魚草S基因座中首次克隆到與花粉自交不親和性決定因子相關的基因SLF（S-locus F-box）[2]；隨后相繼在茄科[3]、薔薇科[4]等多個物種中發現自交不親和相關的花柱不親和因子S-RNase和花粉不親和因子SLF/SFB（S-locus F-box /S-haplotype specific F-box）；罌粟屬植物中的柱頭S-因子PrsS具有抑制體外花粉管生長的作用[5]。同時，一些非S基因也參與植物自交不親和過程，如抑制HT-B的表達會導致花柱喪失拒絕花粉的能力[6-7]。另外，一些信號分子如Ga2+、肌動蛋白以及蛋白激酶p56會影響花粉管的生長[8]。目前，沙田柚自交不親和的研究已取得一定的進展。薛妙男等[9-10]確定了沙田柚自交中花粉管在花柱中停止生長的位置以及花柱通道細胞中的特異蛋白的產生部位和分布；秦新民等[11-13]分離和鑒定了沙田柚花粉管特異蛋白，同時，花粉管中特異蛋白的產生部位和分布也得到了確定。

SAURs（small auxin up RNAs）基因屬生長素早期響應家族基因三大基因[14]。1987年，首個SAUR基因在大豆下胚軸中被發現[15]。大部分SAUR家族的基因都沒有內含子，含有1個或多個生長素反應元件AuxREs[14]。SAUR基因含有1個下游元件DST，它會導致其編碼的mRNAs極不穩定，易在短時間內被降解[16]。SAUR基因具有1個Auxin-inducible結構域，參與植物的生長素調節活動。研究發現，擬南芥AtSAUR通過調節細胞膨脹來調控下胚軸的生長[17]；OsSAUR54基因在水稻的柱頭中特異表達，可能對花粉管的伸長有促進作用[18]。此外，擬南芥AtSAUR50基因參與光信號介導的花序梗發育[19]。

沙田柚（Citrus grandis var.Shatinyu Hort）是配子體高度不親和果樹。目前，有關SAUR基因參與植物自交不親和性的報道尚少。為進一步探討沙田柚自交不親和的機理，筆者在對沙田柚自交和異交花柱進行轉錄組測序的基礎上，通過對差異基因的分析以及所測的Unigenes進行功能注釋，獲得了1個沙田柚SAUR基因；并對其編碼的蛋白質理化特征以及該基因在沙田柚自交和異交花柱中的表達模式進行了分析，旨在為深入研究沙田柚自交不親和性的分子機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 材料采自廣西靈川縣潮田鄉大山口村果園十年生沙田柚果樹。分別收集人工授粉（沙田柚×沙田柚）和異交授粉（沙田柚×酸柚）1～3 d的花柱以及當天未開花的花柱，將其立即放入液氮中速凍處理，然后保存在-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取、建庫和測序。

總RNA提取采用改良的Trizol法[20]進行，RNA檢測合格后交由深圳華大基因科技服務有限公司建庫和測序，建庫和測序的方法參考文獻[21]的方法進行。

1.2.2 基因序列分析和系統樹構建。

通過NCBI ORF Finder、DNAman、Conserved Domain Search、TMHMM、NetPhos3.1、SWISS-MODEL等軟件對SAUR基因進行序列和理化性質分析。基于氨基酸序列SAUR基因的系統樹用DNAman軟件進行構建。

2 結果與分析

2.1 開放閱讀框預測

沙田柚SAUR基因（Unigene8616_All）序列全長為857 bp（GenBank登錄號為MH281940），通過NCBI ORF Finder和生物信息學軟件DNAman進行分析，該序列的開放閱讀框為381 bp，編碼126個氨基酸（圖1）。

2.2 功能結構域分析

將編碼的氨基酸序列用NCBI上的Conserved Domain Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析，結果表明，該基因轉錄的蛋白質具有1個與Auxin_inducible superfamily蛋白相同的保守結構域（圖2）。

2.3 表達模式分析

SAUR基因在沙田柚未授粉、自交和異交花柱中差異表達較為明顯：在未授粉花柱中其表達量（RPKM）為5.10，自交（ZJ）1、2、3 d花柱中的表達量分別是8.42、56.02、53.45，其表達量在自交2 d中迅速上升，并維持在較高水平。而在異交（YJ）1、2、3 d花柱中的表達量分別是11.98、36.74、8.53，其表達量在異交2 d中上升后則迅速下降。利用RPKM對該基因在自交和異交花柱中的表達水平估算，設定FDRS≤0.001且差異倍數≥2倍的基因為顯著差異表達基因，以RPKM值取2的對數值[log2（RPKM）]對ZJ1/YJ1（8.42/11.98），ZJ2/YJ2（56.02/36.74），ZJ3/YJ3（53.45/8.53）花柱中SAUR基因的表達水平進行統計分析，其log2（RPKM ratio）分別為-0.51、0.61和2.65。此外，在沙田柚自交和異交1～3 d的花柱中，該基因的表達量均明顯高于未授粉花柱。

2.4 編碼蛋白質的分析和疏水性預測

通過DNAman軟件和在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）分析，該基因編碼的蛋白質分子式為C599H946N166O190S7，等電點pI為5.76，分子質量為13.74 kD，不穩定系數為59.75（>40），屬于不穩定蛋白。其中，該蛋白質攜帶的負電荷氨基酸（Asp + Glu）總數為17，正電荷氨基酸（Arg + Lys）總數為14。該基因編碼的肽鏈中疏水性最大值約為2.33，位于第97位氨基酸，最小值約為-3.25，位于第62位氨基酸，該蛋白質疏水性平均值為-0.30，鑒定該蛋白質為親水性蛋白，其疏水性分析結果見圖3。

2.5 跨膜預測

運用跨膜蛋白數據庫 TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對SAUR基因編碼的蛋白進行跨膜區域預測，結果表明該蛋白不屬于跨膜蛋白。

2.6 蛋白質的二級結構和三級結構預測

通過在線軟件SOPMA分析該蛋白質的二級結構，該蛋白的α-螺旋占39.68%、延伸鏈占19.05%、無規則卷曲占41.27%（圖4）。

運用在線軟件（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預測該蛋白的三級結構，該蛋白三級結構包含了2個α-螺旋，由無規則卷曲連接（圖5）。

2.7 蛋白質的磷酸化位點預測

通過在線軟件NetPhos 3.1 Server對沙田柚SAUR基因編碼蛋白進行磷酸化位點預測，結果表明該基因編碼的蛋白質可能的磷酸化位點共有10個（Ser），分別位于肽鏈的12、19、30、50、61、69、84、85、88、116位。

2.8 同源性分析

將沙田柚SAUR基因編碼的氨基酸序列與GenBank數據庫中下載的其他11種植物SAUR基因編碼的氨基酸序列進行比對，結果表明，沙田柚SAUR基因編碼的氨基酸與克萊門柚（Citrus clementina， XP_006452877.1）和甜橙（Citrus sinensis，XP_006474595.1）SAUR基因編碼的氨基酸序列的同源性分別為100%和99%。利用DNAman軟件構建系統發育樹，結果表明沙田柚SAUR基因編碼的蛋白質與克萊門柚和甜橙親緣關系很近，屬于同一進化分支（圖6）。

3 結論與討論

SAUR基因家族是生長素響應因子中最大的一個家族，為植物所特有，在植物的免疫應發、脅迫應答、轉錄和轉錄調控等過程中發揮重要的作用[22]。目前，多種植物的SAUR基因已被克隆[17]，但鮮見關于沙田柚SAUR基因克隆的報道。該研究的Unigene8616_All序列與克萊門柚和甜橙的SAUR基因的同源性分別為100%和99%，同時含有1個Auxin_inducible保守結構域，說明Unigene8616_All序列是1個SAUR基因。

沙田柚SAUR基因在自交1～3 d花柱中的表達量（RPKM）分別為8.42、56.02、53.45；而在異交1～3 d花柱中的表達量分別為11.98、36.74、8.53。

陳騰土等[23]發現，沙田柚授粉3 d花柱的蛋白提取液有明顯抑制自交花粉管生長的作用。研究發現，在體外SAUR蛋白能夠與鈣調蛋白結合，說明SAUR蛋白可能作為第二信使傳導鈣/鈣調蛋白和生長素信號之間的聯系，生長素作用之后SAUR基因編碼的轉錄產物能夠迅速積累[24-26]。沙田柚自交花柱中SAUR的表達量在授粉第2、3天明顯高于異交花柱，推測在沙田柚自交過程中SAUR基因被激活后迅速上調表達，SAUR蛋白與鈣/鈣調蛋白結合，產生級聯反應，參與自交不親和過程。但SAUR基因與沙田柚自交不親和性的分子機理尚有待進一步研究。

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