枸杞總黃酮回流—超聲復合提取工藝優化研究

康磊　于惠

摘要[目的]優化提取枸杞總黃酮的最佳工藝條件。 [方法]以寧夏枸杞作為研究對象，采用回流-超聲復合式提取方法，分別通過單因素試驗及正交試驗設計，對枸杞中的有效成分總黃酮的提取和測定工藝條件進行優化。 [結果]得到枸杞中總黃酮測定的最優條件為 利用石油醚對枸杞先進行回流提取，然后使用60%的乙醇溶液，料液比為1∶40 （g∶mL），在70 ℃條件下提取30 min，取次數為2次。利用優化參數對枸杞中總黃酮的含量測定，經計算，該方法的相對標準偏差（RSD）為0.91%，加標回收率值在98%以上。 [結論]該方法具有準確率高、成本低、設備簡單、操作便捷、易于推廣的特點。

關鍵詞枸杞；總黃酮；提取工藝；回流-超聲復合式提取法

中圖分類號TS201.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）28-0158-04

Study on the Optimized Conditions by Refluxultrasonic Extraction Flavones from Lycium barbarum

KANG Lei1， 2，3，YU Hui1， 2，3

（1.Ningxia Testing Laboratory of Coal Chemical， Yinchuan， Ningxia 750002；2.State Key Testing Laboratory of Coal Chemical， Yinchuan， Ningxia 750002；3.Chemical Laboratory Center of Ningxia Baota， Yinchuan， Ningxia 750002）

Abstract[Objective]To optimize the extraction technology of total flavonoids from Lycium barbarum L. [Method]Taking Ningxia Lycium barbarum L. as the research object， the method of reflux ultrasonic combined extraction was adopted.The extraction and determination of total flavonoids in Lycium barbarum L. were optimized by single factor test and orthogonal design.[Result]The optimum conditions for the determination of total flavonoids in Lycium barbarum were as follows： petroleum ether was used to extract the total flavonoids from Lycium barbarum by reflux， then 60% ethanol solution was used， the ratio of material to liquid was 1∶40 （g∶mL）， and the extraction time was 2 times at 70 ℃ for 30 minutes.The content of total flavonoids in Lycium barbarum was determined by the optimized parameters. The relative standard deviation （RSD） of the method was 0.91%， and the recovery was over 98%.[Conclusion] The method has the characteristics of high accuracy， low cost， simple equipment， convenient operation and easy popularization.

Key wordsLycium barbarum；Total flavonoids；Extraction process；Refluxultrasonic compound extraction method

枸杞（Lycium chinense）別名茍起子、甜菜子、血枸子，屬于茄科枸杞屬植物，國內主要產于寧夏、新疆、甘肅等地區，其中屬寧夏地區產出的枸杞最為有名[1]。枸杞具有較高的藥用價值，具有解熱及治療糖尿病、高血壓、肝腎疾病等功效[2-5]。通過對枸杞有效成分研究發現，枸杞中含有較高的黃酮及蘆丁，其中黃酮類化合物具有多種生物活性，具有抗氧化性和降血脂作用，對預防動脈粥樣硬化有較好的療效[6]。因此，如何高效提取枸杞葉中總黃酮并進行測量成為人們關注的焦點。筆者采用回流-超聲輔助復合提取法對枸杞中的有效成分總黃酮進行了提取，通過對提取條件進行單因素試驗和正交試驗，進一步優化提取枸杞總黃酮的最佳工藝條件，并采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH分光光度比色法，對枸杞中總黃酮的含量進行測試。通過對該方法的精密度和加標回收率進行考察，證明該方法具有操作簡單、重現性好、專屬性較強及穩定性好等優點，易于推廣。

1材料與方法

1.1材料

無水乙醇，分析純（AR），天津市富宇精細化工有限公司；乙醇（95%），分析純（AR），天津市富宇精細化工有限公司；石油醚（60～90 ℃），分析純（AR），天津市富宇精細化工有限公司；亞硝酸鈉，分析純（AR），四川西隴化工有限公司；氫氧化鈉，分析純（AR），西安化學試劑廠；硝酸鋁，分析純（AR），天津市凱通化學試劑有限公司；蘆丁（HPLC≥95%），北京北納創聯生物技術研究院。枸杞子，市售，產自寧夏中寧縣，經鑒定為枸杞的干燥成熟果實。

紫外可見分光光度計（Evolution300），美國；1/10萬電子天平（CP225D），德國sartorius有限責任公司；超聲波清洗器（KQ-5200DE），昆山舒美超聲儀器有限公司；儀表恒溫水浴鍋，上海樹立儀器儀表有限公司；高速多功能粉碎機（RH-100），浙江榮浩工貿有限公司。

1.2測定分析方法

準確移取一定量樣品溶液（視樣品溶液含量而定）置于25.00 mL的具塞比色管中，加入0.8 mL的50 g/L NaNO2溶液，靜置6 min后，加入0.8 mL的100 g/L Al（NO3）3 溶液，再次靜置6 min；后加入40 g/L NaOH溶液10 mL，用乙醇溶液定容至刻度，搖勻，待顯色穩定后，用10 mm比色皿，以試劑空白作為參比溶液，在波長510 nm下測定溶液的吸光度A，根據線性回歸方程計算，求出吸取樣品溶液中的黃酮類化合物的含量。

枸杞中總黃酮的含量按式（1）計算。

w=m2×100m1×V×1 000×1 000（1）

式（1）中，w為黃酮類化合物的總含量（g/kg）；m1為試料的質量（g）；

m2為由標準曲線計算得出的吸取待測試液黃酮類化合物含量（mg）；

V為試液的移取體積（mL）。

1.3標準曲線的確定

分別吸取0、0.25、0.50、1.00、2.50、3.50、5.00、7.50、10.00 mL 0.200 0 g/L蘆丁標準使用液（相當于各溶液中分別含有0、0.05、0.10、0.20、0.50、0.70、1.00、1.50、2.00 mg蘆丁）置于25.00 mL具塞比色管中，按照“1.2”所述方法測定吸光度值，以吸光度（A）作為縱坐標，蘆丁的質量（m）為橫坐標，繪制蘆丁質量（m）-吸光度（A）標準曲線，結果見圖1。蘆丁溶液的線性回歸方程為A=0.485m-0.002 4，R2=0.999 9。其中，A表示溶液的吸光度，m表示蘆丁質量（mg）。

1.4樣品及溶液的制備

將購得的枸杞首先在40 ℃下低溫烘干24 h以除去部分水分，隨后將枸杞放入冰箱冷凍室，在-15～ -10 ℃條件下對枸杞進行冷凍干燥24 h，以防止枸杞在粉碎過程中發生黏連現象。冷凍枸杞樣品取出后應立即用粉碎機粉碎，并迅速過0.5 mm 標準篩。將制備好的枸杞粉末置于密封干燥處低溫保存。

精確稱取枸杞樣品粉末1.0 g（精確至0.000 2 g），置于自制尼龍袋中，封好袋口，放于索氏提取器中，用石油醚進行回流以除去脂類等雜質。待殘渣中的石油醚揮發后，將包有樣品的尼龍袋置于100 mL錐形瓶中，加入乙醇溶液，在一定溫度和超聲頻率下進行超聲提取。多次提取后，合并提取液，并將提取液移至100 mL的容量瓶中，將錐形瓶和尼龍袋用60%乙醇溶液多次洗滌，并將洗滌液一并移入100 mL的容量瓶中，用60%乙醇溶液進行定容，所得溶液待測。

1.5提取工藝條件的優化

該試驗首先考察了乙醇體積分數（Vm）、超聲提取溫度（T）、超聲提取時間（t）、料液比（枸杞質量與乙醇體積的比值）及提取次數（n）在單因素條件下對總黃酮提取工藝的影響。同時，為避免各影響要素間相互交叉影響，在單因素試驗的基礎上，進一步以乙醇體積分數、料液比、超聲提取溫度、超聲提取時間4個因素進行L9（34）正交試驗設計。正交試驗因素水平設計見表1。

2結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響。

由圖2可以看出，增大乙醇體積分數有利于溶劑中的總黃酮更加充分地溶解。然而，當溶劑中乙醇體積分數大于60%時，黃酮提取量呈逐漸下降趨勢，這可能是由于過高的提取液體積分數容易導致枸杞中更多的雜質溶出造成的。因此，該研究選用體積分數為60%的乙醇進行后續研究。

2.1.2料液比對總黃酮提取量的影響。

由圖3可以看出，當料液比為1∶40（g∶mL）時，枸杞中黃酮提取量到達最大值。在超聲提取過程中，枸杞與溶劑之間產生超聲空化效應[7]，對總黃酮分子的運動起加速作用，使枸杞中的總黃酮較容易溶解到溶劑中。隨著溶劑的增加，有助于總黃酮的提取。但當料液比中溶劑過大時，過多的雜質溶出，不利于總黃酮的提取。因此，選擇使用1∶40（g∶mL）的料液比較為合適。

2.1.3超聲提取溫度對總黃酮提取量的影響。

如圖4所示，隨著提取溫度的上升，枸杞中黃酮提取量呈先增大后緩慢減小的趨勢，當提取溫度為 60 ℃時黃酮提取量到達最大值。在超聲作用下，隨著溫度的升高，更多的枸杞總黃酮分子被溶解釋放出來，黃酮提取量逐漸升高。然而，當提取溫度過高時，一方面高溫容易使枸杞中更多的雜質被溶解出來，使得枸杞中黃酮提取量相對降低；另一方面，過高的溫度可能會致使總黃酮的氧化，從而降低黃酮的提取量。

2.1.4超聲提取時間對總黃酮提取量的影響。

圖5為超聲時間對枸杞中黃酮提取量的影響。如圖5所示，當超聲時間相對較短時，枸杞中的總黃酮無法充分提取出來，因此黃酮提取量相對較低。隨著超聲時間的延長，黃酮提取量顯著增大。當超聲時間超過30 min之后，隨著超聲時間的增長，由于枸杞中雜質析出的干擾，黃酮提取量有所下降。

2.1.5超聲提取次數對總黃酮提取量的影響。

從圖6可以看出，提取1次的提取量最大，提取1次的提取量約是第2次提取的10倍左右，而第3～5次的提取量很低。超聲對化學反應的促進作用可以歸結為超聲加熱作用、機械傳質作用及超聲空化這3個方面[8]。3個方面的作用不僅可以提高反應體系中黃酮分子向外擴散的速度，還可降低反應體系中黃酮分子擴散層的厚度，有利于總黃酮的析出與提取；同時，超聲空化作用可進一步疏通枸杞內部的擴散通道，利用超聲空化作用產生的大量微小氣泡，將總黃酮從枸杞內部提取出來，進而提高提取效率。因此反應采用超聲提取工藝后，提取次數可明顯減少。因此，從縮短試驗周期、節約能源方面綜合考慮，選擇提取2次。

2.2正交試驗確定枸杞總黃酮提取的最佳提取條件全面考慮提取工藝條件對提取結果的影響，根據上述單因素試驗的結果，設計L9（34）正交試驗，試驗結果見表2。

根據正交試驗結果進行分析，各個要素對枸杞中總黃酮提取率影響的大小情況依次為乙醇體積分數>超聲溫度>超聲提取時間>料液比。同時，由正交優化確定的最佳提取條件為乙醇體積分數60%，料液比1∶40（g∶mL），超聲溫度70 ℃，超聲提取時間30 min，超聲提取次數2次。

2.3精密度試驗及加標回收率試驗

2.3.1精密度試驗。

分別準確稱取枸杞粉末1.00 g（平行3份），按照樣品溶液制備辦法處理，采取“1.2”的辦法顯色之后，在波長510 nm下，測定溶液的A。精密度結果見表3。從表3可知，RSD值為0.91%，說明此方法的精密度數據良好。

2.3.2加標回收率試驗。

表4為加標回收率試驗結果，從表4中可知，通過在超聲階段加入不同量的蘆丁標準品，得到該方法的加標回收率值均在98%以上，進一步證明該提取和檢測方法的可靠性。

3結論

試驗通過采用回流-超聲復合式提取法來提取枸杞中的總黃酮，依次對提取液體積（Vm）、料液比、提取時間（t）、提取溫度（T）及提取次數（n）進行單因素試驗。之后以Vm、料液

比、T、t為因素的正交試驗，選擇出超聲輔助提取枸杞總黃酮的最佳工藝條件為選擇提取液體積為60%，料液比為1∶40（g∶mL），在70 ℃下提取30 min，反復提取2次。各個因素對枸杞中的總黃酮提取效果影響的順序依次是：Vm>T>t>料液比。利用上述優化參數對枸杞中總黃酮含量進行測定，經計算，該方法的相對標準偏差（RSD）為0.91%，加標回收率值在98%以上。該工藝條件很簡單，操作步驟比較容易，穩定性高，能夠有效克服常規辦法提取溫度高、提取時間長等操作步驟繁瑣的缺點。

參考文獻

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