文心蘭PAD4基因克隆及表達分析

郭艷芳 王叢巧 李蓉 陳裕坤 賴鐘雄 王天池

摘? 要? 為了研究文心蘭（Oncidium hybridum）抗病相關基因PAD4在文心蘭抗病種質資源培育中的功能，采用RT-PCR結合RACE法，從巧克力文心蘭（Oncidium Sharry Baby ‘Sweet Fragrance）中克隆得到一條全長2 214 bp的基因的cDNA序列，開放閱讀框長1 894 bp，預測可編碼647個氨基酸，5′UTR長度為65 bp，3′UTR長度為255 bp。生物信息學分析表明：PAD4編碼的蛋白屬于水解酶超家族，有6個跨膜螺旋，無信號肽，亞細胞定位預測其主要定位于細胞質膜上。系統進化樹表明，文心蘭PAD4與同為蘭科植物的小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）、鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）、深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica）親緣關系最近。同源分析結果顯示，與鐵皮石斛的PAD4蛋白同源性最高（78.08%）。實時熒光定量PCR分析顯示，PAD4在文心蘭不同組織部位中都有表達，在假鱗莖中的表達量最高，其次是下端葉，在根中的表達量最低。接種軟腐病病原菌顯示，PAD4在感病文心蘭中表達量上調，侵染后4 h時快速響應并達到最高值。SA（salicylic acid）和CaCl₂都能夠誘導PAD4的表達，都在24 h時達到最高峰。研究表明，PAD4基因可能在文心蘭抗病過程中有重要作用。

關鍵詞? 文心蘭;抗病;PAD4;基因克隆;表達分析中圖分類號? S31 ?????文獻標識碼? A

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.016

文心蘭，蘭科（Orchidaceae）文心蘭屬（Oncidium）植物的總稱，為全球重要的切花植物，其花序分支性好，花形優美，花朵奇異可愛。巧克力文心蘭（OncidiumSharry Baby ‘Sweet Fragrance）作為文心蘭的一個栽培品種，花朵數可達百朵，花期長達兩個半月，開花時又因其具有巧克力奶油香氣的顯著特征而成為人們關注的焦點^[1]，具有很高的市場價值。文心蘭切花高峰期集中于高溫高濕季節，在文心蘭栽培過程中極易感染軟腐病、褐斑病、根腐病等細菌性病害，炭疽病、圓斑病等真菌性病害以及病毒病^[2]。各種病害給文心蘭產業帶來嚴重的損失，嚴重阻礙了文心蘭產業的發展。由于文心蘭及其近親種屬缺乏有效對抗文心蘭病害的抗病基因，通過常規育種來提高文心蘭的抗性比較困難^[3]，因此篩選抗性相關基因，培育抗性文心蘭品種對文心蘭產業的發展具有重要意義。

植物受到病原菌侵染后可以通過植物系統獲得性抗性（SAR）抵御病原菌的侵擾，植物抗病基因（R）與病原菌無毒基因（avr）能夠相互識別，并通過R基因下游的一些基因整合不同的抗病信號，通過水楊酸途徑將抗病信號傳遞下去^[4-5]。PAD4作為一個抗病信號途徑基因，是在通過尋找突變體植株對脫毒的十字花科黑斑病菌增強了感病性基因時發現的^[6]，其編碼一個核質蛋白，序列與脂肪酶類似^[7]，與三酰甘油脂肪酶基因同源，屬于水楊酸信號途徑的上游基因，在系統獲得性抗性中，水楊酸是其發揮功能的關鍵信號分子。水楊酸作為SAR信號轉導途徑的一種內源信號分子，在植物的SAR信號轉導中起著關鍵作用^[8]，其誘導的植物防御對抵抗病原體的侵擾至關重要。PAD4作為依賴SA（salicylic acid）防御反應的調控子^[9]，在抗病基因介導的植物抗性中起到重要的作用，能夠在植物生長發育過程中抵御病菌的侵害及逆境脅迫。當病原菌入侵植物組織后，會產生一個移動信號，通過植物維管系統激活末端組織來防御病害^[10]。在SA介導的抗病信號途徑中，病原菌對植物的侵染會使植物局部組織發生超敏反應，誘導植物抗毒素等物質的合成，并伴隨水楊酸水平提高，激發下游PR蛋白的表達，使植物獲得系統性抗性^[11-12]。PAD4控制植物防御信號的合成，對蔓延性植物病毒能產生抗性，研究表明外援噴施SA后能夠促進PAD4大量表達^[13-14]，從而提高植物自身的抗病性。PAD4作為植物自身的抗病信號途徑基因在植物的抗病進程中有著重要的地位，因此利用文心蘭本身的遺傳抗性在研究文心蘭病害中是值得嘗試的一種方式。目前對PAD4的研究多集中在水稻^[6]、茄子^[15]、煙草^[16]等植物上，在文心蘭中未見報道。本研究以巧克力文心蘭為材料，采用RACE-PCR技術克隆了巧克力文心蘭PAD4基因的全長序列，使用實時熒光定量PCR對文心蘭不同組織部位、病原菌侵染文心蘭不同時間和外源激素處理下PAD4基因的表達量進行定量分析，了解PAD4基因表達情況，為文心蘭的抗病性研究奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1材料

本實驗以巧克力文心蘭組培苗為材料，由福建農林大學園藝植物生物工程研究所提供。取樣后用液氮預冷處理并保存于–80 ℃冰箱備用。

1.2方法

1.2.1? 文心蘭總RNA提取及其cDNA第一鏈合成? 采用Trizol UP RNA提取試劑盒（全式金生物技術有限公司）提取樣品總RNA，用Thermo超微量核酸檢測儀檢測RNA樣品濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其清晰度與完整性，保存于–80 ℃冰箱備用。采用GeneRacer^TM試劑盒（TaKaRa）將已經提取的文心蘭總RNA反轉錄為第一鏈cDNA用于5′端的克隆，采用SMARTer RACE Kit試劑盒（TaKaRa）將已經提取的文心蘭總RNA反轉錄為第一鏈cDNA用于3′端和保守區的克隆。用SYBR ExScript^TM（TaKaRa）逆轉錄試劑盒將已經提取的總RNA反轉錄成cDNA用于熒光定量PCR分析。具體使用步驟見說明書。

1.2.2PAD4基因全長序列的擴增 ?從文心蘭轉錄組中獲得PAD4的部分核苷酸序列，采用DNAMAN 6.0在其開放閱讀框（ORF）序列兩端設計一對特異性引物PAD4-ORF-F和PAD4-ORF- R（表1），以巧克力文心蘭第一鏈cDNA為模板，進行PCR擴增，克隆該基因ORF序列。然后根據已知的ORF序列分別設計出2條3′RACE的特異性引物和2條5′RACE的特異性引物（表1），結合SMARTer RACE Kit 3′和3′巢式引物以及GeneRacer^TM5′和5′巢式引物，以巧克力文心蘭cDNA為模板，分別擴增出3′和5′端序列，用DNAMAN 6.0進行全長拼接。以上所用引物均由華大基因科技公司合成。

PCR反應采用25 μL體系：Dream Taq^TMGreen PCR Master Mix （2×） 12.5 μL，ddH₂O 9.5 μL，模版cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL。保守區克隆PCR擴增程序為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s、57 ℃退火45 s、72 ℃延伸2 min 30 s，34個循環，最后72 ℃延伸5 min并4 ℃保存。3′和5′端克隆PCR擴增程序為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s、55～59 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，34個循環，最后72 ℃延伸5 min并4 ℃保存。

1.2.3? TA克隆與測序? 所有的PCR產物均用1%凝膠電泳，然后將目標片段的PCR產物采用Gel/PCR Extraction Kit進行膠回收，連接PMD18-T載體后轉化大腸桿菌DH5α中進行TA 克隆并挑選陽性克隆搖菌，然后進行菌液PCR擴增，將帶有目的條帶的菌液送至華大生物技術有限公司測序。

1.2.4? 文心蘭PAD4生物信息學分析? 利用NCBI的ORF Finder對PAD4的cDNA序列的開放閱讀框進行查找;通過NCBI Conserved Domain Search預測蛋白的保守結構域;采用ExPASy- ProtParam tool進行氨基酸序列的理化性質預測;利用Signal P4.1Server預測蛋白質的信號肽;用TMpred Server進行蛋白跨膜預測;用PSORT WWW Server進行亞細胞定位預測;用KinasePhos預測蛋白的磷酸位點;通過COLIS Server進行卷曲螺旋結構分析;分別用SOMPA和SWISS-MODEL對PAD4基因編碼的蛋白進行二級結構分析與三維結構預測。采用MEGA 6.0 Neighbor-Joining構建系統進化樹，利用NCBI網站的BLAST程序搜索PAD4蛋白的相似性序列并進行同源比對。

1.2.5? 文心蘭PAD4基因的表達分析? 以Actin作為內參基因，根據熒光定量引物設計原則和獲得的序列設計1對特異引物PAD4-QF和PAD4-QR（表1），進行PAD4的表達模式分析。提取文心蘭不同組織部位（根、假鱗莖、上端葉、下端葉、花）的總RNA備用。用實驗室保存的軟腐病病菌侵染文心蘭假鱗莖，于侵染前的0 h與侵染后的4、8、12 h取樣。分別用1 μmol/L SA、0.5 μmol/L CaCl₂噴施文心蘭組培苗葉片，噴施直至葉片流水為止，然后在處理前的0 h與處理后的1、3、6、12、24、48 h分別取葉片，所有樣品取樣后立即用液氮速凍保存于–80 ℃備用。采用Trizol UP RNA試劑盒提取所有樣品的總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，然后用Thermo超微量核酸檢測儀檢測RNA樣品濃度與OD值。逆轉錄為cDNA模版用于定量PCR實驗。將cDNA樣本混合物進行5倍梯度稀釋，分別對PAD4基因和內參基因進行擴增，獲得標準曲線、溶解曲線和擴增曲線以確定引物特異性和擴增效率。將所有樣品的cDNA 稀釋10倍作為模板進行擴增。采用SYBR premix Ex Taq^TMⅡkit（TaKaRa）進行qRT-PCR反應。反應采用20 μL體系：2× SYBR 10 μL，ddH₂O 7.4 μL，cDNA模版1 μL，上下游引物各0.8 μL，每種處理做3個生物學重復。使用羅氏LightCycler 480儀器，程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸15 s，40次循環。依據2^–??Ct法計算PAD4基因的相對表達量。

2? 結果與分析

2.1巧克力文心蘭cDNA全長序列的獲得

以巧克力文心蘭的cDNA為模板，進行PCR擴增以及驗證PAD4基因的ORF序列，電泳顯示目的片段大小約1 800 bp（圖1-A），經測序驗證ORF長度為1 894 bp。以PAD4-GSP1和PAD4- GSP2為特異引物，進行3′RACE巢式PCR擴增，電泳檢測得到一條500 bp左右的目的片段（圖1-B），測序顯示其長度448 bp;以PAD4-GSPa和PAD4-GSPb為特異引物，進行5′RACE巢式

PCR擴增，電泳檢測得到一條600 bp左右的條帶（圖1-C），測序顯示其長度為606 bp。將獲得的5′端、3′端和ORF序列利用DANMAN 6.0軟件進行拼接，共得到2 214 bp的全長序列，包括1 894 bp的ORF，編碼蛋白由647個氨基酸組成，5′-UTR為65 bp，3′-UTR為255 bp，polyA尾巴為33 bp（圖2）。經BLAST分析表明，該片段與多種植物尤其是蘭科植物的PAD4基因具有很高的同源性，初步認定它是文心蘭PAD4基因的片段。

2.2 ?PAD4的理化性質和結構分析

用ExPASy-ProtParam tool進行氨基酸序列的理化性質預測。結果顯示，該蛋白分子式為C₃₁₉₂ H₅₀₀₄ N₈₆₄ O₉₀₅ S₄₄，相對分子質量為71 374.73，理論等電點為8.27，不穩定系數51.91，Grand average of hydropathicity （GRAVY）值為–0.074，脂肪族指數為87.99。NCBI-CDD預測到該蛋白的保守結構域在1～631肽鏈區間，屬于水解酶超家族;利用Signal P4.1Server預測信號肽顯示PAD4不含信號肽，不屬于分泌蛋白。用PSORT Prediction分析預測顯示該蛋白定位于細胞質膜上（可信度：0.820）;用TMpred Server進行蛋白跨膜預測，顯示PAD4蛋白屬于跨膜蛋白，有6個跨膜螺旋。用KinasePhos預測蛋白的磷酸位點表明PAD4蛋白有10個磷酸化位點，含有9個絲氨酸、1個蘇氨酸，沒有絡氨酸。用COLIS Server進行卷曲螺旋結構分析，顯示PAD4沒有形成卷曲螺旋結。通過SOMPA在線軟件進行二級結構預測，顯示其編碼蛋白的氨基酸序列中有354處α-螺旋（alpha helix）、50處外延伸鏈（extended strand）、17處β-轉角（beta turn）和210處無規則卷曲（random coil），分別占二級結構的56.10%、7.92%、2.69%和33.28%。因此α-螺旋和無規則卷曲是PAD4的主要結構原件。利用 SWISS- MODEL軟件預測文心蘭PAD4蛋白的三維結構，從圖3可以看出PAD4蛋白的主要結構元件還是螺旋和卷曲，與二級結構的預測結果相符。

2.3 ?PAD4的同源性序列比對及進化樹構建

為了研究PAD4的進化關系，構建系統進化樹。結果表明，PAD4與同為蘭科植物的鐵皮石斛、小蘭嶼蝴蝶蘭親緣關系最近，歸在同一分支（圖4）。利用NCBI中的BLAST程序將文心蘭PAD4編碼的氨基酸序列與其他6個物種的PAD4編碼的氨基酸序列進行同源性比對，結果顯示文心蘭PAD4與鐵皮石斛PAD4相似度高達78.08%，與小蘭嶼蝴蝶蘭PAD4相似度為75.31%，與深圳擬蘭、鳳仙花、油棕、野果芭蕉相似度也都在50%以上，比對發現文心蘭PAD4蛋白與其他6種植物蛋白在C端的序列保守性更高，在蘭科植物的進化過程中具有高度的保守性（圖5）。

2.4 文心蘭PAD4基因的表達特性

熒光定量結果顯示，PAD4基因在文心蘭不同組織部位的表達差異顯著。在根、假鱗莖、上端葉、下端葉和花中均有表達，在根中的表達量最低，在假鱗莖中表達量最高，是根中表達量的3倍，在下端葉中表達量略微低于假鱗莖，也接近在根中表達量的3倍，其次是上端葉和花（圖6）。軟腐病病菌侵染文心蘭假鱗莖后，PAD4的表達量先上調后下降，在4 h時達到最高值，8 h時降到最低（圖7），說明PAD4在軟腐病的侵染過程中對病原菌比較敏感，在接種部位能夠快速響應軟腐病菌的侵染并作出表達。1 μmol/L SA噴施文心蘭葉片能夠誘導PAD4的表達，PAD4的表達量先上升再下降，再上升再下降，出現2個峰值，6 h時PAD4的表達量達到第一個高峰，12 h時PAD4的表達量下降到最低然后開始上升，24 h時PAD4的表達量達到最高值，約為0 h的3.5倍，然后開始下降，整體呈“M”趨勢。0.5 μmol/L CaCl₂噴施文心蘭葉片能夠顯著誘導PAD4的表達，PAD4的表達量先下降再上升再下降，CaCl₂噴施文心蘭葉片1 h后表達量略微下降然后開始上升，24 h達到最高值然后開始下降，最高值約為0 h的7倍（圖8）。SA信號通路作為植物調控誘導抗性的重要通路，參與植物的抗病過程，Ca²⁺信號參與SA防御途徑，同時又作為細胞的第二信使參與植物的抗病防衛反應中^[17-18]，SA和CaCl₂處理植株后PAD4的表達量顯著上調，說明PAD4在文心蘭抗病過程中起到正調控的作用。

3? 討論

3.1? PAD4是一個定位于細胞質膜的水解酶超家族蛋白

本研究基于文心蘭轉錄組中找到抗性相關基因PAD4并對其進行全長克隆，得到全長為2 214 bp文心蘭PAD4基因，其中該基因CDS長1 894 bp，預測可編碼647個氨基酸，PAD4不含信號肽，不屬于分泌蛋白，亞細胞定位預測其定位于細胞質膜上。通過對PAD4蛋白分析顯示PAD4蛋白脂肪族指數高達87.99，屬于水解酶超家族。PAD4與同屬于水解酶家族的EDS1為互作蛋白，它們的N端都有與酰基水解酶同源的結構域^[19]，兩者協同作用能夠促進SA的積累增加水楊酸誘導的植物防御并放大PAD4的功效，使PAD4的功能保持穩定^[20-21]。進一步研究發現，PAD4和EDS1結合后還能夠在鈣信號的影響下激活水楊酸合成途徑中的關鍵酶ICS1（isochorismate synthase 1）從而誘導SA的合成參與植物抗病的過程^[22]。PAD4在文心蘭不同組織部位表達量差異較大，在假鱗莖中表達量最高，在下端葉和上端葉的表達量都超過根的2倍，但在上端葉沒有下端葉的高，這可能與下端葉的位置接近于假鱗莖有關，在花中的表達量接近于在根中表達量的1.5倍，說明該基因屬于組織特異性表達模式。

3.2? PAD4通過水楊酸信號途徑在文心蘭抗病過程中發揮著重要作用

SA途徑作為植物主要的防衛反應信號傳導途徑，有很多防衛反應信號蛋白調節SA的生成積累，最終影響植物的抗病反應。PAD4作為調控SA途徑的信號蛋白，是由抗性基因介導的觸發性免疫反應中的重要調節劑^[23]，通過SA介導的抗病途徑來提高植物的抗性。研究表明在應答某些信號時，PAD4對于激活SA表達是必需的，不同的抗性基因通過不同的途徑介導植物的抗性反應。軟腐病病菌接種文心蘭假鱗莖后，PAD4的表達量在4 h時快速上調，說明PAD4在接種部位快速響應并達到最高值，文心蘭在受到軟腐病侵染后接種部位的PAD4基因立即響應病菌的侵染，說明PAD4可能會在文心蘭抗病過程中發揮作用。水楊酸作為植物抗病途徑中的重要信號要素，在病原物相互作用過程中，植物體內發生信號傳導，PAD4在SA和CaCl₂的處理下表達量整體上調，SA可以通過正反饋環路來增加PAD4的表達，同時PAD4又可以促進水楊酸的積累，激發植物的防御體系使植物產生抗病性反應^[24]。Ca²⁺作為細胞信號傳導信使能夠參與水楊酸的合成來提高植物的抗病性^[25]，研究表明，外援Ca²⁺的處理能夠提高SA誘導番茄抗灰霉病的能力^[26]，同時也可以增加PAL、POL等抗病性酶活性和促進酚類物質與木質素等抗病物質的積累來增強植物抗病性^[27]，PAD4在CaCl₂的處理下做出響應，說明PAD4參與文心蘭的抗病反應中。

3.3 ?PAD4參與植物的其他抗性活動

植物抗病信號途徑復雜多樣，整體呈網絡狀的各個途徑交叉互作，PAD4與其他病原基因相互作用在植物抗病反應中。PDA4在植物抗性的研究中，不僅能夠增加植物對病原菌的抗病性，而且在植物抗病蟲和植物抗衰老方面也有一定的作用，在擬南芥中PAD4能夠伴隨著植物韌皮部的防御機制來調控葉片的早衰，同時也能夠調節韌皮部蚜蟲的防御機制來限制蚜蟲對植物的傷害^[28-29]，調節植物營養和生殖生長，在干旱脅迫下的生存中發揮重要作用^[30]。通過對文心蘭PAD4 基因進行克隆與表達分析，了解PAD4在文心蘭健康植株與感病植株中的表達情況，下一步可以進行文心蘭PAD4基因敲除或通過轉基因技術得到轉基因植株，進一步研究文心蘭PAD4的抗病性，為文心蘭抗病新種質的培育提供進一步的研究基礎。

參考文獻

1. 葉? 煒， 李永清， 江金蘭. 利用信息學技術追溯巧克力文心蘭親本及育種應用情況[J]. 三明農業科技， 2013（1）： 14-17.
2. 易綺斐， 劉東明， 陳紅鋒， 等. 蘭花主要病害及其防治[J]. 植物保護， 2004， 30（1）： 71-73.
3. 吳曉佩， 謝禮洋， 白? 玉， 等. 文心蘭鐵氧還蛋白基因克隆定位及表達分析[J]. 西北植物學報， 2017（1）： 48-58.
4. 趙淑清， 郭劍波. 植物系統性獲得抗性及其信號轉導途徑[J]. 中國農業科學， 2003， 36（7）： 781-787.
5. Dangl J L， Jones J D G， Dangle J L， et al. Plant pathogens and integrated defence in plants [J]. Nature， 2001， 411（6 839）： 826-833.
6. Glazebrook J， Rogers E E， Ausubel F M. Isolation of Arabidopsis mutants with enhanced disease susceptibility by direct screening[J]. Genetics， 1996， 143（2）： 973-982.
7. 李慶亮， 李? 捷， 胡增麗， 等. PAD4基因在植物抗性方面的作用[J]. 農業與技術， 2017（7）： 1-2.
8. Wang X， Sager R， Cui W， et al. Salicylic acid regulates Plasmodesmata closure during innate immune responses in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2013， 25（6）： 2 315-2 329.
9. Nan Z， Tootle T L， Tsui F， et al. PAD4 functions upstream from salicylic acid to control defense responses in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 1998， 10（6）： 1 021-1 030.
10. Pieterse M J， Leon-Reyes A， Ent S V D， et al. Networking by small-molecule hormones in plant immunity[J]. Nature Chemical Biology， 2009， 5（5）： 308-316.
11. Feys B J， Parker J E. Interplay of signaling pathways in plant disease resistance[J]. Trends in Genetics， 2000， 16（10）： 449-455.
12. 賈燕濤. 植物抗病信號轉導途徑[J]. 植物學通報， 2003， 20（5）： 602-608.
13. Bartsch I， Wiencke C， Bischof K， et al. The genus Laminaria sensu lato： recent insights and developments[J]. European Journal of Phycology， 2008， 43（1）： 1-86.
14. Jirage D， Tootle T L， Reuber T L， et al. Arabidopsis thaliana PAD4 encodes a lipase-like gene that is important for salicylic acid signaling[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1999， 96（23）： 13 583-13 588.
15. 肖熙鷗， 蔣? 晶， 陳? 娜， 等. 茄子調控抗青枯病反應信號基因的篩選和鑒定[J]. 園藝學報， 2016（7）： 1 295-1 304.
16. 路子峰， 張? 超， 李彥忠. 林煙草8個防衛反應信號蛋白編碼基因的克隆及RNAi植物表達載體的構建[J]. 草業科學， 2014， 31（7）： 1 275-1 282.
17. Jiang J F， Li J G， Dong Y H. Effect of calcium nutrition on resistance of tomato against bacterial wilt induced by Ralstonia solanacearum[J]. European Journal of Plant Pathology， 2013， 136（3）： 547-555.
18. Steinhorst L， Kudla J. Calcium and reactive oxygen species rule the waves of signaling[J]. Plant Physiology， 2013， 163（2）： 471-485.
19. Wiermer M， Feys B J， Parker J E. Plant immunity： the EDS1 regulatory node[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2005， 8（4）： 383-389.
20. Feys B J， Moisan L J， Newman M A， et al. Direct interaction between the Arabidopsis disease resistance signaling proteins， EDS1 and PAD4[J]. EMBO Journal， 2001， 20（19）： 5 400-5 411.
21. Cui H， Gobbato E， Kracher B， et al. A core function of EDS1 with PAD4 is to protect the salicylic acid defense sector in Arabidopsis immunity[J]. New Phytologist， 2017， 213（4）： 1 802-1 817.
22. 張夢姝， 牛宏偉， 侯春燕， 等. 植物免疫中的EDS1[J]. 中國細胞生物學學報， 2016（11）： 1 398-1 404.
23. Rietz S， Stamm A， Malonek S， et al. Different roles of Enhanced Disease Susceptibility1 （EDS1） bound to and dissociated from Phytoalexin Deficient4 （PAD4） in Arabidopsis immunity[J]. New Phytologist， 2011， 191（1）： 107-119.
24. 丁麗娜， 楊國興. 植物防御激素介導的信號途徑間的交叉對話[J]. 西北植物學報， 2016（5）： 1 066-1 072.
25. Du L， Ali G S， Simons K A， et al. Ca²⁺/calmodulin regulates salicylic-acid-mediated plant immunity[J]. Nature， 2009， 457（7 233）： 1 154-1 158.
26. 李琳琳， 李天來， 姜國斌， 等. 外源Ca²⁺對水楊酸誘導番茄抗灰霉病的增效機制[J]. 應用生態學報， 2015（11）： 3 497-3 502.
27. 余朝閣， 李天來， 張亢亢， 等. 鈣對茉莉酸甲酯誘導番茄抗灰霉病及防御酶活性的調控作用[J]. 中國蔬菜， 2012 （18）： 166-170.
28. Pegadaraju V， Knepper C， Reese J， et al. Premature leaf senescence modulated by the Arabidopsis PHYTOALEXIN DEFICIENT4 Gene is associated with defense against the phloem-feeding green peach aphid[J]. Plant Physiology， 2005， 139（4）： 1 927-1 934.
29. Pegadaraju V， Louis J， Singh V， et al. Phloem-based resistance to green peach aphid is controlled by Arabidopsis PHYTOALEXIN DEFICIENT4 without its signaling partner ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY1[J]. Plant Journal， 2007， 52（2）： 332-341.
30. Szechyńska-Hebda M， Czarnocka W， Hebda M， et al. PAD4， LSD1 and EDS1 regulate drought tolerance， plant biomass production， and cell wall properties[J]. Plant Cell Reports， 2016， 35（3）： 527-539.