牛樟EST—SSR標記的開發及遺傳多態性分析

郭鶯　孟紅巖　林文珍　林志楷　劉黎卿

摘 要 本研究通過測序牛樟葉片cDNA獲得17 046條Uni-EST，從中檢測出1 316個SSR位點，平均每 25.7 kb EST含1個SSR位點。功能注釋發現1 242條SSR-EST中有690條可被劃分為3大功能類、18個功能亞類。牛樟EST-SSR二核苷酸重復類型出現頻率最高，三核苷酸次之。184類重復基序中AG/CT出現頻率最高（32.4%），其次為AAG/CTT（9.3%）。從1 242條SSR-EST設計SSR引物537對，隨機選取150對檢測牛樟的多態性及在香樟、大葉樟和沉水樟中的可轉移性。結果表明，有44對引物在牛樟中得到特異性擴增，其中17對具有多態性，檢測出的等位基因數2～7個，平均3.02個。牛樟SSR標記在香樟、沉水樟和大葉樟的可轉移率分別為97.7%、97.7%和95.3%。聚類分析表明，在遺傳相似系數為0.76處，14個樟屬植物能被劃分為5類，聚類結果與植物學分類結果基本吻合。

關鍵詞 牛樟；EST-SSR；標記開發；遺傳多態性

中圖分類號 Q949.747.5 文獻標識碼 A

Abstract 17 046 Uni-ESTs were generated by sequencing cDNA of Cinnamomum kanehirae， of which 1 316 SSR loci were identified with 1 SSR on every 25.7 kb EST. Analysis of GO （gene ontology） showed that 690 SSR-ESTs could be divided into three major functional categories and 18 functional sub-categories. Di-nucleotide repeat was the most abundant repeat type followed by tri-nucleotide repeat in EST of C. kanehirae. In 184 motif types， AG/CT （32.4%） was the most abundant followed by AAG/CTT （9.3%）. Based on the 1 242 SSR-EST， a total of 537 primer pairs were successfully designed. 150 primer pairs were randomly selected to detect the polymorphism in C. kanehirae and test transferability in C. camphora， C. micranthum and C. parthenoxylon. The results showed that 44 primer pairs were specifically amplified in C. kanehirae， of which 17 pairs were polymorphic and the number of alleles detected was 2–7， with an average of 3.02. The transfer rates of C. kanehirae SSR marker in C. camphora， C. micranthum and C. parthenoxylon were 97.7%， 97.7% and 95.3%， respectively. Cluster analysis showed that at the genetic similarity coefficient 0.76， 14 Cinnamomum plant samples could be divided into five groups. The clustering result was in good agreement with the result of botany classification.

Keywords Cinnamomum kanehirae； EST-SSR； marker development； genetic polymorphism

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.014

牛樟（Cinnamomum kanehirae Hay），又名黑樟，隸屬于樟目（Laurales）樟科（Lauraceae）樟屬（Cinnamomum），是臺灣原生特有樹種，被列為國家三級重點保護植物。牛樟既是木雕、家具和建筑的上等原料，同時也是一種具有很高觀賞價值的景觀樹種。牛樟整個植株含有芳香油，其主要成分黃樟油素是香料洋茉莉醛的原料，在工業上具有廣泛的用途。此外，牛樟是牛樟芝（Antrodia camphorata）的寄生樹種。牛樟芝在醫學上被稱為“藥芝之王”，具有強化免疫、抗癌、抗過敏、降血脂、解毒保肝等藥用和保健功效[1]。近年來，重要林木的遺傳多樣性及遺傳育種研究取得長足進展[2-3]。然而，由于缺乏有效的DNA標記，目前有關牛樟的資源收集分類、遺傳多樣性及遺傳育種研究進展仍相當緩慢。因此，開發高效的DNA標記成為牛樟遺傳資源開發利用的當務之急。

近年來，通過第二代DNA測序技術快速獲得的EST（expressed sequence tag）數據成為SSR（simple sequence repeat）的重要來源[4]。與genomic-SSR相比，EST-SSR具有其特殊優勢：（1）信息量大，EST-SSR屬于表達基因的一部分，當此基因控制某一性狀，則該標記與此性狀相關[5]；（2）可轉移性高，與非轉錄區相比，來自轉錄區的EST-SSR序列保守性更強，故在近緣物種中具有更高的可轉移性，可作為比較基因組學研究中的公共標記[6]；（3）開發簡便、快捷、成本低，EST-SSR標記的開發通常是轉錄組數據分析的“副產品”，幾乎不用成本。目前經濟林木如橡膠樹、胡楊、云杉、牡丹、茶樹等已開發大量的EST-SSR[7-11]，并應用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、基因定位及QTL分析等研究上[12-14]，但在牛樟上至今尚未開發出EST-SSR標記。

本研究在測序獲得牛樟葉片EST序列數據的基礎上，通過分析牛樟EST-SSR的分布頻率及特征，開發牛樟EST-SSR標記，并對其在牛樟中的多態性和其他樟屬植物上的可轉移性進行評價，為后續牛樟遺傳資源的開發利用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 牛樟葉片cDNA文庫測序獲得的2.4 Gb EST序列數據。用于EST-SSRs檢測的牛樟樣本8個，香樟（Cinnamomum camphora）4個，沉水樟（Cinnamomum micranthum）和大葉樟（Cinnamomum parthenoxylon）各1個，由福建省亞熱帶植物研究所提供（表1）。

1.1.2 試劑與儀器 磁珠法植物DNA提取試劑盒（貨號：AU3111，百泰克，中國），Hiseq 2500測序系統（Illumina，美國），超微量分光光度計（型號：Nanodrop 2000，Thermo Scientific，德國），Fragment AnalyzerTM自動化毛細管電泳系統（型號：FSV2-CE，生產商：美國AATI）。

1.2 方法

1.2.1 牛樟葉片RNA提取及EST測序 從牛樟樣本C. kanehirae-1選取嫩葉作為測序材料，液氮速凍，置于80 ℃冰箱中，凍存備用。隨后提取牛樟葉片總RNA，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物的mRNA，加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模版，用random hexamers（六堿基隨機引物）合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，cDNA質量檢測合格后經過末端修復、3加polyA和連接測序接頭，建好的文庫在Hiseq 2500測序系統進行100 bp雙末端（paired-end）測序。RNA提取、反轉錄、建庫、測序和序列拼接等過程由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.2.2 樟屬植物DNA提取 采用磁珠法植物DNA提取試劑盒提取樟屬植物葉片基因組DNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，用超微量分光光度計測定DNA濃度。所有DNA樣本用超純水統一稀釋至50 ng/μL，并保存于20 ℃備用。

1.2.3 SSR位點搜索 原始牛樟EST序列拼接為Uni-EST，采用MISA（MIcroSAtellite identification tool）軟件（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）從中搜索SSR位點。搜索標準為二、三、四、五、六核苷酸基序（motif）重復次數分別≥10、7、5、4、4。由于難以區分EST-SSR中的單核苷酸重復序列A/T與cDNA中的PolyA/T，故本研究未將單核苷酸重復序列列入搜索范圍。根據搜索標準，MISA配置文件（misa.ini）中參數設置為2-10、3-7、4-5、5-4、6-4，其中數據對第一個數字代表SSR基序長度，第2個數字代表基序重復的最少次數。

1.2.4 SSR引物設計 采用Primer Premier 5軟件（http：//www.premierbiosoft.com/primerdesign/）從SSR位點側翼序列設計引物。引物設計標準：（1）引物長度18～24 bp；（2）引物GC含量40%～ 60%；（3）預期擴增產物大小100～500 bp；（4）引物最適溶解溫度（Tm）72 ℃，最適復性溫度55 ℃。

1.2.5 PCR擴增及檢測 PCR擴增體系為20 μL：基因組DNA 50 ng，0.15 μmol/L正反向引物， 0.2 mmol/L dNTPs，1 U Taq DNA聚合酶，1×PCR緩沖液（50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.1%明膠，10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3）。PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 5 min。擴增產物經Fragment AnalyzerTM自動化毛細管電泳系統進行電泳檢測。

1.2.6 SSR-EST的功能注釋 為了研究牛樟SSR-EST的基因功能，本研究應用Blastx工具

（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），將1 242條牛樟SSR-EST在Uniprot數據庫（http：//www. uniprot.org/）中進行同源比對（E-value Le-5）。根據Uniprot數據庫的GOA（Gene Ontology Annotation）系統進行功能分類。通過基因的相似性進行功能注釋，序列比對匹配標準：（1）分值（score）>80；（2）序列一致性（identity）>35%。

1.2.7 SSR-ESTs ORF預測 利用Open Reading Frame Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）尋找SSR-EST中的開放閱讀框架（open reading frame， ORF），預測SSR位點坐落于5-UTR（5untranslated region）、CDS（Coding sequence）或者3-UTR（3untranslated region）。

1.2.8 聚類分析 統計EST-SSR引物在實驗材料中檢測的等位基因數，同一電泳遷移位置上，有電泳峰的記為1，無峰的記為0，聚類分析采用NTSYSpc軟件（http：//www.exetersoftware.com/cat/ ntsyspc/ntsyspc.html），聚類方法為非加權配對算術平均法（unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA）。

2 結果與分析

2.1 牛樟EST-SSR分布特點

將牛樟葉片cDNA文庫測序獲得的原始序列拼接后獲得17 046條Uni-EST。通過MISA軟件共搜索到1 316個SSR位點，分布于1 242條EST中，出現頻率為1 SSR/25.7 kb，其中70條EST含有一個以上的SSR。二、三、四、五、六核苷酸重復在牛樟EST-SSR中均存在，且出現頻率存在明顯差異。出現頻率最高為二核苷酸重復，占44.1%（581個）；其次為三核苷酸重復，占23.6%（310個）；四、五、六核苷酸重復分別只占9.1%、13.5%和9.6%（表2）。本研究中牛樟EST-SSR平均長度為21 bp，二、三、四、五、六核苷酸重復長度分別為20.4、21.5、20.6、20.6和25.7 bp（表3）。牛樟EST-SSR二至六核苷酸基序的出現頻率隨著重復次數的增加而急劇下降，如重復10次的二核苷酸基序有469個，重復11次的只有105個，而重復12次的僅有7個。

本研究中牛樟EST-SSR種類較為豐富，包含184種基序類型，二至六核苷酸重復分別含有3、10、21、56和94種基序類型。由圖1可知，出現頻率最高的基序類型為AG/CT（32.4%），其次是AAG/CTT（9.3%），第3是AT/AT（8.9%）。

2.2 SSR-EST的功能注釋

由于SSR-EST屬于表達基因的一部分，EST- SSR與genomic-SSR相比最大的優點是具有某些生物學功能。本研究檢測到了牛樟1 242條SSR- EST，其中690條SSR-EST被注釋到3大功能類、18項功能亞類中，剩余552條SSR-EST因數據庫中缺乏與之相似的基因序列而無法進行功能注釋（表4）。在與功能大類“生物過程”相關的232條SSR-EST所涉及的11項功能亞類中，34.5%與細胞過程相關，17.8%與代謝過程相關，11.6%與細胞發育相關。與分子功能相關的258條SSR- EST所涉及的11項功能中，與結合因子相關的EST數量最多（31.8%），其次是與催化反應相關的（27.5%）。與細胞組分相關的200條SSR-EST所涉及的6項功能中，與細胞相關的占54.5%，與細胞質部分相關的占20.5%，其余占25%。

2.3 EST-SSR多態性分析

對1 242條牛樟SSR-EST進行引物設計，其中705條因SSR側翼序列長度不夠無法設計，最終只成功設計出537對SSR引物。為檢測引物的擴增效果，隨機挑選150對引物擴增8份來自不同地區的牛樟樣本DNA（表1）。結果表明，在牛樟中能擴增出特異條帶的引物有44對，另有43對只擴增出非特異性條帶，剩余63對無任何擴增產物。特異性擴增引物中，有38對擴增長度與預期完全一致，另有1對大于預期，5對小于預期。43對牛樟特異性擴增引物在香樟、沉水樟和大葉樟上同樣能產生有效擴增，可擴增率分別為97.7%、97.7%和95.3%，平均可擴增率為96.9%，表明牛樟EST-SSR在其他3種樟屬植物中具有很高的可轉移性。

44對特異性擴增引物中有43對在8個牛樟樣本中能檢測出多態性。每對引物檢測出2～6個等位基因（圖2），平均3.02個（表5），總共檢測到134個等位基因。44對牛樟特異性EST-SSR引物在14個樟屬植物樣本間均能檢測出多態性。每對引物檢測出等位基因數2～8個，平均4.3個，累計檢測出等位基因數189個。

SSR位于5-UTR、CDS和3-UTR的特異性擴增引物在牛樟中平均檢測出的等位基因數分別為3.57、2.56和2.67個（表5）。顯然，在牛樟EST中，位于5-UTR和3-UTR的SSR比位于CDS的擁有更高的多態性。

2.4 樟屬植物的聚類分析

聚類分析表明，樟屬植物樣本間的遺傳距離為0.89～0.74（圖3）。在相似系數為0.76處，14個樟樹植物樣本可聚為5類，第1類包含8個牛樟樣本，樣本間的遺傳距離為0.89～0.765；第2類包含1個香樟樣本（C. camphora-2）和1個大葉樟樣本（C. parthenoxylon）；第3類只包含沉水樟樣本（C. micranthum）；第4類只包含1個香樟樣本（C. camphora-1）；第5類包含2個香樟樣本（C. camphora-3和C. camphora-4）。

3 討論

本研究通過轉錄組測序獲得17 046條Uni- EST，搜索出1 316個SSR位點，共有1 242條EST（7.2%）含SSR，表明牛樟EST中SSR較為豐富，但與其他木本植物如洋槐（13.9%）[15]、橡膠樹（23.9%）[16]、花楸（7.7%）[4]等相比，其EST-SSR含量仍偏低，其原因在于不同木本植物上EST-SSR搜索的標準不同。本研究中采用的搜索標準較為嚴格，首先是不包含單核苷酸重復，其次是二、三、四、五、六核苷酸重復的次數分別至少為10、7、5、4、4，遠高于其他研究的標準。

植物EST-SSR以三核苷酸和二核苷酸重復類型為主[17]，其中三核苷酸重復多見于被子植物，但也有部分木本植物以二核苷酸重復為主，如楊樹、茶樹、山胡椒等[18-20]。本研究中牛樟EST-SSR的二核苷酸重復占44.1%，明顯高于三核苷酸重復（23.6%），這與楊樹、茶樹等其他木本植物的研究結果相似。牛樟EST-SSR的重復基序類型以AG/CT（32.4%）、AT/AT（8.9%）和AAG/CTT為主（9.3%），與橡膠樹[16]和檸條[21]等相似，這也是被子植物中最豐富的重復類型。

本研究用的150對EST-SSR引物有63對無擴增產物，另外43對產生非特異擴增，擴增失敗的比例較高，其原因可能是：（1）由于牛樟基因組的復雜性，導致部分Uni-EST序列無法正確拼接；（2）上下游引物位點間有一個或多個長片段內含子；（3）擴增區段存在比較復雜的高級結構。在可擴增的44對引物中有1對擴增產物長度大于預期，這可能與擴增產物含有內含子，或者發生小片段DNA插入有關。

理論上，由于EST受選擇壓力的影響，序列的保守性比基因組其他區域更高，因此與genomic- SSR相比，EST-SSR在近緣物種間具有更高的可轉移性。目前有關植物EST-SSR的可轉移性研究均支持上述觀點[6]。本研究表明牛樟EST-SSR在其他樟屬植物中均具有較高的可轉移性。

聚類分析表明EST-SSR聚類結果與植物學分類結果基本吻合，如8個牛樟樣本單獨聚為一類，能夠完全與其他樟屬植物區分開來。但由于形態性狀和DNA標記間通常缺乏顯著的相關性，導致基于形態性狀的植物學分類和EST-SSR聚類結果并不完全一致。此外，由于牛樟EST-SSR在其他樟樹植物上的擴增特異性降低，也可能造成聚類結果出現偏差。如牛樟EST-SSR將不屬于同一個種（species）的香樟樣本C. camphora-2和大葉樟樣本C. parthenoxylon聚為一類。

EST-SSR具備信息量大、通用性好、開發簡捷成本低等多個優點，但同時也存在明顯的缺點，即多態性低。研究表明，SSR位點的多態性與其核苷酸重復次數呈正相關，重復次數越多，多態性越高[22]。EST-SSR核苷酸重復次數明顯低于genomic-SSR，因此對應的多態性也偏低[23]。此外，基因編碼區序列的保守性可能也是導致其多態性偏低的原因，特別是編碼區內的核苷酸重復次數的變動容易產生致死性的移碼突變，長期的自然選擇壓力嚴重抑制了編碼區內的核苷酸重復次數的變動。由于本研究在進行EST-SSR開發時設置的搜索標準較高，SSR核苷酸重復次數較其他研究高，且多數SSR位點落在非編碼區，因此在牛樟和樟屬植物中均檢測到較高的多態性。說明在開發EST-SSR引物時應選擇基序重復次數高的SSR-EST序列，同時避免SSR位點落在編碼區，以提高EST-SSR的多態性。

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