超低溫對降香種子遺傳變異和生理特性的影響

曾琳 顧雅坤 吳怡 魏建和

摘 要 采用單因素隨機區組試驗方案探究降香種子玻璃化超低溫保存最適條件，結合顯微切片觀察和生理生化特性檢測對冷凍后細胞形態和生理生化指標變化進行分析，同時運用形態觀察法和相關序列擴增多態性（SRAP）分子標記法對超低溫保存后的降香植株遺傳穩定性進行檢測。結果表明：降香種子玻璃化超低溫保存最佳條件為：室溫（25 ℃）裝載25 min，0 ℃ 玻璃化脫水30 min，40 ℃水浴解凍5 min。對比檢測不同冷凍時間的降香種子超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、α-淀粉酶、脫氫酶活性、丙二醛（MDA）含量以及電導率等生理生化指標，無明顯差異。顯微觀察超低溫保存前后的降香種胚內部結構，未見明顯變化。超低溫保存后的降香種子發芽時，出現短暫的生長停滯期，恢復培養后，其表觀形態指標與對照植株無明顯差異。SRAP技術分析了超低溫冷凍前后的降香再生植株，其SRAP帶型基本一致，未見明顯差異帶型。綜上表明，超低溫保存降香種子是長期穩定、安全可靠的。

關鍵詞 超低溫保存；降香；遺傳變異；生理生化特性

中圖分類號 R931.2 文獻標識碼 A

Abstract In this study， we used a single factor random block test to optimize cryopreservation procedure of Dalbergia odorifera T. Chen seed by vitrification. The embryo cells of Dalbergia before and after frozen were inspected with microscope by paraffin section method， and the change of physiological and biochemical indexes of seeds before and after frozen were analyzed. In addition， the genetic stability of regenerated plantlets after cryopreservation was tested with sequence—related amplified polymorphism （SRAP） molecular marker method. The results showed that the optimal conditions for Dalbergia odorifera seeds vitrification were 25 min loading condition at room temperature， 30 min dehydration condition at 0 ℃ and 5 min thawing condition at 40 ℃. The was no significant difference in seed physiological and biochemical indexes of different freezing time， and when inspected by microscope before and after cryopreservation， the internal structure of the embryo had no obvious variations. These results suggest that the time of cryopreservation had no significant effect on germplasm preservation of Dalbergia odorifera. When sprouted the seed of Dalbergia odorifera after freeze in liquid nitrogen， there had a short period of stagnation， but the morphological indexes did not vary greatly with those of the control after renewal cultivation. No nucleotide sequence had been altered during cryopreservation， which was indicted by no obvious differences in the banding patterns of DNA fragments between survival material and the control material of the Genomic DNA analyzed by SRAP after cryopreservation. In conclusion， the ultarlow- temperature preservation of Dalbergia odorifera seeds was stable， safe and reliable.

Keywords cryopreservation； Dalbergia odorifera； genetic variation； physiological and biochemical traits

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.008

自1973年Nag等[1]首次成功地將液氮超低溫保存技術運用在胡蘿卜懸浮培養細胞上以來，超低溫保存技術已成功保存了近300種植物材料[2]。大多數的植物材料在超低溫環境中，其細胞的新陳代謝活動都會基本停止[3]，從而使細胞的活力和形態發生的能力能夠得到穩定保存。液氮冷凍主要是對植物材料存活率和生理生化指標有影響，從理論上講，經過液氮處理后再生的植物材料不會發生遺傳變異[4-6]。但是植物材料在超低溫保存過程中，除液氮冷凍外，還涉及預培養、脫水、解凍和恢復培養等，這些過程會給植物材料造成脅迫，增加植物材料的氧化損傷[7]，傷害到植物細胞，從而影響植物材料的再生[8]，并可能對再生植株的遺傳穩定性造成一定影響[9-10]。曾繼吾等[11]在用透射電鏡觀察番木瓜（Carica papaya L.）莖尖超低溫保存過程中細胞超微結構變化時發現，細胞嚴重傷害主要發生在液氮冷凍和解凍過程。程志英[12]在觀察超低溫保存后的菊花（Dendranthema morifolium）莖尖組織結構時發現，PVS2脫水對莖尖造成嚴重損傷，且液氮冷凍和解凍對莖尖組織細胞造成了不可逆的損傷。所以在對植物材料進行超低溫長期儲藏前，應對超低溫冷凍的幾個步驟進行優化。

超低溫保存植物材料不止是為了獲得高存活率，也是為了得到安全、穩定、保真的再生植株[11]，因此對超低溫儲藏后的遺傳穩定性進行研究是非常有必要的。植物材料表型特征評估可能是檢測超低溫儲藏對植株穩定性影響的最簡單的方法[6]。大部分研究表明，超低溫保存后的材料在形態學方面沒有明顯的變化[12]。在對超低溫保存后的山藥（Dioscorea opposite Thunb.）種質[13]、橡膠（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）愈傷組織[14]、栓皮櫟（Quercus variabilis Blume）胚[15]的再生植株中沒有發現形態變化，但超低溫處理后的杭菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.t. Dulce.）[5]再生苗早期營養生長指標均低于對照。多數研究證明，超低溫保存前、后材料的基因組沒有發生遺傳穩定變異[12]。在對超低溫保存前后的五葉草莓（Fragaria pentaphylla Losinsk.）[16]、留蘭香

（Mentha spicata Linn.）[17]、人參（Panax ginseng C. A. Mey）[2]、杭菊（Dendranthema morifolium （Ramat.） Tzvel.）[5]、君遷子（Diospyros lotus L.）[18]等植物種質材料進行基因組遺傳穩定性檢測時，沒有發現基因組改變現象；但在冷杉（Abies fabri （Mast.） Craib）、番木瓜等植物種質材料中卻發現其基因組改變的現象[9]。

降香（Dalbergia odorifera T. Chen）是我國特有的瀕危藥用植物，其種子屬于頑拗性種子[19]，筆者所在實驗室對降香的種子進行了液氮超低溫保存，發現適宜含水量的種子超低溫保存后均能發芽，但部分芽不能健康地成苗。推測是因為液氮超低溫保存過程中的一系列脅迫對降香種子造成了影響。本研究進一步探究降香種子的超低溫保存最適條件，結合顯微切片觀察和生理生化特性檢測對超低溫冷凍后種子細胞形態和生理生化指標變化進行分析，并運用序列相關擴增多態性（SRAP）分子標記技術從基因組遺傳穩定性方面對超低溫保存前后的降香植株遺傳穩定性進行分析，以期獲得穩定、長期保存降香種子的最優方法。

1 材料與方法

1.1 材料

將國家南藥基因資源庫提供的降香種子置于干燥器皿中，獲得含水量為12.5%～13.5%的種子實驗材料，密封存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 超低溫保存方法 對降香種子玻璃化冷凍步驟[19]進行優化：（1）室溫（25 ℃）裝載處理0～20 min；（2）0 ℃ PVS2玻璃化脫水處理0～ 90 min；（3）液氮冷凍0～7 d；（4）40 ℃水浴解凍30 s～10 min；（5）1.2 mol/L蔗糖的MS培養液+純凈水洗滌；（6）恢復培養：將洗滌后的種子接種到含有0.3 mol/L蔗糖的1/2 MS培養基上，25～28 ℃條件下發芽培養。

1.2.2 遺傳穩定性檢測

1）形態學觀察 定期觀察、記錄超低溫冷凍前后的降香種子發芽率，以及降香再生植株在葉形、葉色、株型和株高上與對照是否存在差異。

2）SRAP分析 采用TIANGEN DNAsecure Plant Kit提取降香再生植株總DNA，–20 ℃保存備用。選用楊云等[20]篩選出的適合降香材料分析的25組SRAP引物，并參照其SRAP分子標記實驗程序對降香再生植株進行基因組遺傳穩定性分析。

1.2.3 生理生化指標檢測 取對照和液氮冷凍30 min、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d的種子各0.5 g，分別提取酶液，并測定以下指標。采用3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）測定α-淀粉酶活性[21]，氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定種子活力，氮藍四唑法（NBT法）檢測脫氫酶活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性[22]，紫外分光光度法測定過氧化氫酶（CAT）活性，愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性[23]，硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量[24]，參照姜文[25]電導率測定方法測定降香種子電導率。

1.2.4 石蠟切片顯微觀察 取對照和液氮冷凍30 min、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d的種子其種胚各12顆，進行石蠟切片：FAA固定72 h，梯度酒精各脫水4 h，浸蠟2 h，埋蠟，Leica RM2245半自動輪轉式切片機切片，脫蠟，番紅、固綠溶液雙重染色處理，脫水處理，封膠制成永久切片，Nikon生物顯微鏡觀察。

1.3 數據分析

采用SAS 9.3軟件中的ANOVA對實驗數據進行多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 降香種子玻璃化冷凍程序優化

對降香種子玻璃化冷凍程序中的裝載、PVS2脫水以及解凍3個步驟進行了單因子實驗處理（圖1）。隨著裝載液處理時間的延長，降香種子發芽率呈上升趨勢，但在處理25 min后趨于穩定。實驗結果表明，PVS2處理30 min時，降香種子的發芽率最高，處理時間過短或過長都不利于種子的發芽。隨著40 ℃水浴解凍時間的延長，降香種子發芽率有所提高，5 min過后其發芽率急劇下降，這可能是因為時間過短，種子和冷凍保護劑還未完全解凍，時間過長，種子吸水膨脹從而損害細胞。

綜上所述，降香種子玻璃化超低溫保存最適條件為：裝載處理25 min，PVS2處理30 min，40 ℃水浴解凍5 min。

2.2 液氮冷凍時間對降香種子存活率和理化性質的影響

2.2.1 液氮冷凍時間對降香種子生活力的影響 隨著液氮冷凍時間的延長，降香種子生活力呈下降趨勢，但在冷凍3 d時出現上升，這可能是在液氮的刺激下，激發了種子細胞的防衛反應。降香種子生活力雖下降了，但仍在80%以上（圖2）。

2.2.2 液氮冷凍時間對降香種子生理生化特性的影響 如圖3所示，隨著冷凍時間的增加，降香種子生理生化指標值均有所變化。其中，丙二醛含量隨著冷凍時間的延長，其值上下浮動，但變化不大，這說明液氮冷凍對降香種子細胞膜脂過

氧化作用影響不大。相對電導率在冷凍3 d和5 d時其值上下波動，但波動幅度不大，最終與對照相差無幾，說明液氮冷凍未對降香種子膜質造成損傷。α-淀粉酶活性的變化呈下降、上升交替現象，最終趨于穩定并高于對照，表明液氮冷凍促進了可溶性糖的積累，提高了細胞的抗逆性。脫氫酶活性在冷凍1～2 d時急劇下降，但冷凍3 d后又上升至穩定不變，說明液氮冷凍改變了種子催化氧化還原酶的能力。過氧化氫酶活性在冷凍1 d時開始下降，說明種子活力下降了；在冷凍3 d時出現小幅上升，這可能是細胞出現的短暫性保衛反應；這結果與圖2結果一致。過氧化物酶活性在冷凍1 d時下降幅度較大，隨后又開始上升并趨于平穩，最終高于對照，這可能是液氮冷凍影響了活性氧清除系統的能力，從而導致細胞內活性氧、自由基的量變化不均。超氧化物歧化酶活性隨著冷凍時間的延長，緩慢上升，這表明在液氮冷凍刺激下種子清除自由基的能力增強了。

2.2.3 液氮冷凍時間對降香種胚組織的影響 對不同冷凍時間處理的降香種胚進行石蠟切片顯微觀察，結果如圖4所示，對照組種胚細胞排布緊密、且細胞內含物分布均勻；冷凍后的種胚細胞均出現輕微的質壁分離，其中液氮冷凍30 min和3 d的種胚細胞質壁分離最明顯，冷凍3、5、7 d的種胚出現少量空洞區域，而冷凍1、2 d的種胚細胞排布均勻緊密。總體而言，不同冷凍時間處理的種胚細胞結構沒有出現較大的差異，這說明冷凍時間的長短對降香種胚細胞結構無顯著影響。

2.3 超低溫保存后再生植株遺傳穩定性檢測分析

2.3.1 形態特征比較 對照種子接入培養基培養2～3 d即可發芽，冷凍處理1 d的種子需3～5 d發芽。出芽后200 d，再生植株與對照植株在葉形、葉色、株型、株高上未見明顯差別（圖5）。

2.3.2 SRAP技術檢測基因組穩定性 應用SRAP技術對超低溫冷凍1 d后和對照組的降香種苗進行檢測分析，25組引物均能擴增出清晰的條帶，共擴增出可統計條帶542條。每組引物對2個處理組樣品擴增的多態性位置基本相同，部分條帶如圖5所示（從左至右其引物分別為：M8E7、M8E16、M9E11[20]），說明對照與超低溫冷凍后的降香種苗之間基因組序列保持一致，未發生遺傳變異。

3 討論

本研究進一步探究了降香種子玻璃化超低溫保存最適條件。研究過程中發現：裝載時間越長降香種子活力越高，但在25 min后趨于穩定，這是由于裝載液進入種子細胞內，增加了細胞內的滲透壓同時也降低了冰點，起到了保護種子的作用；隨著PVS2處理時間的延長，降香種子發芽率出現先上升后下降現象，這可能是由于處理時間過短導致的玻璃化不完全，從而導致種子在凍存過程中受到損傷，當處理時間過長時，冷凍保護劑二甲亞砜對種子的毒害作用導致了種子發芽率的下降。同時發現，超低溫冷凍時間對超低溫保存降香種子的存活率并無顯著影響，這與Mony等[26]、朱文濤等[18]、郭強梨等[19]、李俊慧等[27]的研究相符。

植物組織在受到外界脅迫時會產生大量自由基，使得膜脂過氧化生成MDA，MDA含量的增加導致細胞中離子大量外滲，從而導致植物組織相對電導率增加[28-29]。然而，植物組織中也有防御系統，SOD、POD、CAT和脫氫酶是植物組織重要的保護酶，可以減少或清除活性氧自由基，防止自由基對植物組織的毒害[30]。SOD可消除氧自由基產生過氧化氫，POD和CAT可分解過氧化氫為水，這正是植物體本身對外界脅迫在生理生化方面所做出的積極反應[29]。本實驗結果顯示，超低溫保存后的降香種子MDA含量和相對電導率略有下降，而SOD、POD、CAT和脫氫酶活性均略高于冷凍前，即超低溫冷凍后降香種子內膜過氧化能力稍有提高。這是由于液氮超低溫冷凍過程給植物組織制造了一個低溫脅迫環境，在這個環境中，植物組織體內的SOD、POD酶活性會增強，以清除活性氧自由基，從而降低植物體內的活性氧自由基和MDA含量，導致相對電導率降低[29， 31]。

對植物種質資源保存來說，不僅要保證物種的延續，而且也要盡可能確保其再生植株的遺傳穩定性[32]。超低溫保存可以避免田間保存和繼代培養過程中產生的遺傳變異和突變的風險，實現植物種質資源長期、安全、穩定保存[33]。本研究中，降香種子生活力隨著液氮冷凍時間的延長，并未出現大幅度降低的現象，這保證了降香種質的延續。在對降香再生植株表觀形態觀察時發現，超低溫冷凍后的降香種子與對照相比，恢復培養時出現2～3 d的停滯期，可能是由于種子在超低溫保存過程中其生理狀態受到影響造成的。但培養一段時間后，冷凍處理組與對照組的生長狀態表現一致，這保證了降香種質再生植株的形態穩定，與木茼蒿[34]、人參[2]、菊花[35]種質資源超低溫保存后的結果一致。采用SRAP分子標記技術對超低溫保存后的降香再生植株進行基因組遺傳穩定性檢測時，未檢測到遺傳變異，這確保了降香種質的遺傳穩定性。綜上所述，降香種子液氮超低溫保存技術是安全可靠的。

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