相思樹懸浮細胞培養及其細胞形態學觀察

林秀蓮 葉玲娟 林玉玲 徐小萍 張梓浩 賴鐘雄

摘 要 試驗分析了基因型、愈傷組織類型、2，4-D濃度、蔗糖濃度，起始接種量等各因素對相思樹懸浮細胞培養的影響。結果表明：選擇淡黃色，質地鮮嫩松脆的愈傷組織作為相思樹懸浮培養的材料，能較快地建立起懸浮細胞系。黑木相思細胞小，胚性強，分散性好，最容易建立起懸浮細胞系。當蔗糖濃度為30 g/L，2，4-D濃度為0.5 mg/L時，適宜于懸浮細胞的保持。起始接種量對相思懸浮細胞系生長也有很大影響，從保持懸浮細胞系的角度看，每瓶25 mL培養基中適宜的接種量為0.5～1.0 g。臺灣相思懸浮細胞培養周期以7 d繼代1次，卷莢相思懸浮細胞培養周期以8～10 d為宜。同時，通過對懸浮細胞培養的顯微觀察可以看出不同基因型的相思樹懸浮細胞，其細胞生長狀態各不相同。

關鍵詞 相思樹；懸浮細胞；細胞學觀察

中圖分類號 S687；Q813.1 文獻標識碼 A

Abstract The effects of different genotypes， callus types， concentrations of 2，4-D， sucrose concentrations， and inoculation amount on the cell suspension culture were analyzed in the experiment. The results showed that the best initial material of the Acacia spp. for cell suspension culture was the fresh yellow， loose and soft callus II and Ⅲ， which were propitious to establish the suspension cell culture system quickly. In addition， the cells of the A. melanoxylon were small， of strong embryogenic characteristics and fine dispersion， which were easy to establish the cell suspension system. The cell suspension could be maintained well under the conditions that the sucrose concentration was 30 g/L and the 2，4-D concentration was 0.5 mg/L. And the initial inoculation amount also influenced the culture of cell suspension， of which the best inoculation amount was 0.5-1.0 g in 25 mL calli each bottle. The suitable subculture cycle of the cell suspension culture was 7 d in A. confusa， while 8-10 d in A. concinnata. By the histological observation， it showed that there were different cell growth in different genotypes.

Keywords Acacia spp.； cell suspension； histological observation

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.016

相思樹是中國引種的重要速生樹種，在中國南方短周期工業原料林發展、水土保持和豐富林木種質資源等方面具有重要作用和地位[1]。植物細胞懸浮培養是植物細胞生長的微生物化，由于其分散性好，細胞形狀及細胞團大小大致相同，而且生長迅速，重復性好，易于控制等有利因素[2]，因此被廣泛用于細胞學、生物化學、生理學、發育生物學、遺傳學、分子生物學的研究。懸浮單細胞或小細胞團不僅可直接進行遺傳轉化、原生質體分離、體細胞雜交等的研究，還可用于生產次生代謝物以及篩選細胞突變體等，因此懸浮細胞已經成為植物生物技術中一個最有用的工具之一[3]。本實驗室林珊珊[4]、姬明[5]分別對臺灣相思和黑木相思的懸浮細胞系的建立和保持做了研究，葉玲娟[6]研究了相思樹的細胞培養及其體胚發生，黃敬文等[7-8]利用黑荊樹懸浮細胞進行低 溫馴化，Vengadesan等[9]建立了藤金合歡的懸浮細胞系并通過體胚發生方式獲得再生植株，Arumugam等[10]利用臺灣相思懸浮細胞系進行了誘導子對抗氧劑誘導的影響，Hustache等[11]建立了阿拉伯膠樹的懸浮細胞系。同時，Gantait等[12]和Vengadesan等[13]對相思樹的組織培養與快繁應用做了比較詳細的評述。

本文以臺灣相思（Acacia.confusa）、卷莢相思（A. concinnata）及黑木相思（A. melanoxylon）愈傷組織為材料，建立了相思樹的懸浮細胞系，比較了愈傷組織類型、不同的2，4-D濃度、不同的蔗糖濃度、不同接種量對相思樹懸浮細胞生長的影響。并在此基礎上，研究了相思樹的懸浮細胞再生愈傷組織及其細胞學觀察，以期為相思樹遺傳轉化、細胞突變體篩選等提供優良的試驗體系，為苗木快繁、體胚誘導、原生質體分離及有用次生物質生產等方面的研究奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以臺灣相思、卷莢相思及黑木相思愈傷組織為材料[4]，由福建農林大學園藝植物生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 不同基因型相思樹懸浮細胞系的建立 選取繼代培養15 d，鮮重0.5 ～1.0 g，生長旺盛、質地松散的卷莢相思、臺灣相思及黑木相思愈傷組織，置于盛有液體培養基25 mL的三角瓶（150 mL）中，用鑷子夾碎，而后置于120 r/min的搖床上，在（25± 2） ℃、散射光條件下進行振蕩培養，比較3種相思樹懸浮細胞系建立過程中懸浮細胞生長情況。

鮮重的測定：取細胞懸浮液，放在已知重量的尼龍網上過濾。過濾后用水沖洗，除去培養基，500 r/min下離心5 min，去除水分，稱量后的重量，減去尼龍網（40 μm）重即為懸浮液細胞鮮重。測3次求平均值。

單細胞成活率：在載玻片滴一滴懸浮細胞，用0.4%的伊文思蘭染色，被染為藍色的為死細胞，不被染色的為活細胞，統計一個視野下被染色的活細胞數，統計5個視野求平均值。

1.2.2 愈傷組織類型對相思樹懸浮細胞培養系建立的影響 挑選3種相思樹不同類型的愈傷組織于懸浮培養液中，分別比較臺灣相思白色松軟、綠色較硬、鮮黃色松脆的愈傷組織；卷莢相思白色松軟、淡黃色松脆的愈傷組織；黑木相思白色絮狀、白色松脆的愈傷組織對懸浮細胞系建立的影響。

1.2.3 不同的2，4-D水平對相思樹懸浮細胞生長的影響 將3種相思樹的愈傷組織0.5 g接到MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA的培養基中附加不同濃度的2，4-D的液體培養基中，2，4-D濃度梯度為：0.05、0.2、0.5、1、2、4 mg/L，統計2，4-D濃度對這3種不同品種相思樹懸浮細胞鮮重增長量及單細胞生成率的影響。培養基配制如下：

X1：MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+0.05 mg/L 2，4-D

X2：MS+1 mg/L B A+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L 2，4-D

X3：MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 2，4-D

X4：MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+1 mg/L 2，4-D

X5：MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+2 mg/L 2，4-D

X6：MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+4 mg/L 2，4-D

單細胞生成率的測定：取一滴培養7 d后含相思樹懸浮細胞的培養液于載玻片上，在顯微鏡下觀察，測定不同角度的5個視野下單細胞所占的比率，測定3次，求平均值。

1.2.4 不同的蔗糖濃度對相思樹懸浮細胞生長的影響 選取已建立的細胞分散、生長旺盛的懸浮細胞系，培養于下面6個培養基（表1），比較不同碳濃度對卷莢相思和臺灣相思懸浮細胞培養的單細胞生成率的影響，以及對臺灣相思懸浮細胞生長狀況的影響。

1.2.5 不同接種量對相思樹懸浮細胞培養的影響 分別挑取淡黃色、松散愈傷組織0.1、0.3、0.5、1.0、1.0、2.0、2.5 g于25 mL的液體培養基MS+ 2.0 mg/L BA+1.0 mg/L KT+0.5 mg/L 2，4-D，蔗糖30 g/L中。7 d后觀察細胞生長情況。統計懸浮細胞達到最大密度所需的時間、細胞鮮重并計算其增長率。增長率=（培養7 d后細胞鮮重-初始接種量）/初始接種量×100%。測定3次，求平均值。

1.2.6 相思樹懸浮細胞生長曲線的繪制 取來源相同的懸浮細胞分成9瓶進行編號，每瓶取鮮重為0.5 g的愈傷組織，加入25 mL的液體培養基進行培養，從培養當天開始，每2 d測定其鮮重。

以上培養基中均添加蔗糖30 g/L，pH值均為5.8，并在1.1 kg/cm2 、121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2.7 相思樹懸浮細胞系的再生 取繼代培養而得3種相思樹懸浮細胞系直接滴固體培養基上進行平板培養，觀察懸浮細胞愈傷再生情況。

1.2.8 相思樹懸浮細胞生長過程細胞學觀察 取培養在液體懸浮培養基（培養基為30 g/L蔗糖，MS培養基中添加LH300 mg/L的無激素培養基，pH 5.8）中的懸浮細胞液，滴于載玻片上，放在倒置顯微鏡下觀察懸浮細胞分裂與發育情況，并顯微攝影記錄。

1.3 培養條件

懸浮細胞培養于HZQ-QX型全溫振蕩器中，轉速120 r/min，光照300 lx，12 h/d。

2 結果與分析

2.1 基因型對相思樹細胞懸浮系建立的影響

不同基因型在建立穩定懸浮系的過程中表現不同，其特征差異如表2所示。3種相思樹通過方差分析無顯著差異。卷莢相思細胞較大，10 d左右就能快速建立細胞分散性好，細胞團由5～10個小細胞組成的懸浮細胞系（圖版I-A）。而臺灣相思的細胞較小，粘連性強，在繼代2周后才能建立起多由10～20個或5～10個小細胞組成的小細胞團的懸浮細胞系（圖版I-C）。黑木相思愈傷組織的分散性最強，在懸浮培養液中，細胞立即分散開，能建立良好的懸浮細胞培養液（圖版I-B）。通過對懸浮細胞特征的觀察還發現，黑木相思細胞分散性最好，形成的細胞懸浮液中，單細胞或小細胞團個數最多，成活率也比較高，但懸浮細胞鮮重的增長量最小。而臺灣相思和卷莢相思細胞懸浮液的各項指標都差異不大。

2.2 不同類型愈傷組織對相思樹懸浮細胞培養的影響

利用不同類型的愈傷組織進行懸浮培養的結果表明，愈傷組織的形態類型直接影響懸浮細胞的生長狀態。對于臺灣相思3種形態的愈傷組織來說，白色松軟的愈傷組織形成的懸浮細胞系，

細胞形態各異，內含物少；而用綠色堅硬的愈傷組織建立的懸浮細胞系可能由于纖維束分化過多，生長緩慢且不易游離單細胞，難以建立懸浮細胞系。只有色澤鮮黃由致密小顆粒組成的愈傷組織，細胞松散，是臺灣相思細胞懸浮培養的好材料。而卷莢相思的愈傷組織，白色松軟及淡黃松散的愈傷組織來說，同臺灣相思類似，淡黃松散的愈傷組織也是懸浮細胞系建立的最佳材料。同比黑木相思的愈傷組織，其細胞的分散性非常好，愈傷組織均能快速建立起懸浮細胞系。

2.3 2，4-D濃度對相思樹愈傷組織懸浮細胞系建立的影響

在懸浮細胞培養中，2，4-D起著十分重要的作用。將臺灣相思、卷莢相思、黑木相思3種穩定懸浮系接種到附加不同濃度的2，4-D的液體培養基中培養，3種懸浮細胞系表現出明顯的差異性。其結果如圖1和圖2所示：隨著2，4-D濃度的升高，懸浮細胞鮮重都呈先上升后下降趨勢。卷莢相思在2，4-D濃度為0.5 mg/L時細胞增殖倍數最大，隨后逐漸降低；當濃度達到4 mg/L時，細胞生長明顯受抑制，鏡檢發現空細胞增多。臺灣相思和黑木相思懸浮細胞增殖倍數則在2，4-D濃度為1.0 mg/L時最大，隨后降低。而相思樹懸浮單細胞的成活率則是隨著2，4-D濃度的升高而下降。因此，中低濃度的2，4-D水平有利于懸浮細胞系的保持和分化，過高2，4-D濃度不利于穩定懸浮系的建立與保持。因此，本研究選擇0.5 mg/L的2，4-D濃度水平來保持相思懸浮系。

2.4 蔗糖濃度對相思樹細胞懸浮培養的影響

糖類是植物組織和細胞培養中必要的成分之一，一方面它是植物生長提供所必需的營養成分——碳源，另一方面它作為滲透穩定劑維持細胞生長。本文分別研究了蔗糖濃度為0、15、30、50、70、100 g/L對相思樹懸浮細胞生長的影響。其影響結果如圖3所示。

由圖3可看出，當蔗糖濃度為30 g/L時，卷莢相思和臺灣相思分散最好，但隨著蔗糖濃度的上升，懸浮產生的單細胞所占的比率逐漸減小。蔗糖對卷莢相思懸浮細胞培養的影響相對較大，當蔗糖濃度達到30 g/L時，卷莢相思單細胞出現接近48%的分離率，而臺灣相思出現接近40%的分離率。

從表3可看出，蔗糖為30 g/L時最有利于臺灣相思細胞生長，大部分細胞呈圓形，單細胞數目多，細胞碎片少，且細胞生長旺盛，有利于懸浮細胞的保持。蔗糖濃度太高或太低，都容易造成細胞的褐化死亡，且細胞的碎片也增多，細胞多為長條形。這可能是由于如果蔗糖濃度太低，則不足以提供細胞生長足夠的養分，造成細胞的死亡；而如果蔗糖濃度太高，則使培養基形成一個高滲透壓的環境，不利于細胞對外界營養物質的吸取，從而導致細胞的衰亡。因此，選擇30 g/L的蔗糖濃度水平來保持相思懸浮細胞系。

2.5 細胞初始培養密度對相思樹懸浮細胞生長的影響

根據不同重量及不同品種的相思樹松散愈傷組織轉入懸浮培養液中，測定其達到最大密度所需時間、生長量并計算其增殖率，其結果見表4。

由表4可看出，培養密度對相思樹懸浮細胞系生長有很大影響，在每瓶25 mL的液體培養基中，當每瓶接種愈傷組織量在0.3 g以上，懸浮細胞才能正常的繼代增殖；當接種量小于0.3 g時，懸浮小細胞團或單細胞很難再增殖。當每瓶接種愈傷組織在0.3 g以上時，瓶中懸浮培養生長量隨著接種量的增加而增加，達到最大密度所需的時間也隨之縮短，而增長率卻隨之下降，這可能是由于在高密度下培養液中養分消耗殆盡的結果。從表4還可看出，黑木相思懸浮細胞達到最大密度所需的時間最長，而其細胞生長量最少；而卷莢相思懸浮細胞達到最大密度所需的時間最少，其細胞的生長量最大。因此據表分析，卷莢相思和臺灣相思懸浮細胞因其生長迅速，可以選擇每瓶的接種量在0.3 g；黑木相思懸浮細胞生長緩慢，細胞增殖率小，每瓶接種量可以為0.5 g來保持懸浮細胞系。如果為較快獲得懸浮細胞，可將接種量增加至1.5 g左右。

2.6 相思樹懸浮細胞生長曲線的繪制

取來源相同的懸浮細胞，每瓶取鮮重為0.5 g的愈傷組織，加入25 mL液體培養基進行培養，從培養當天開始，每2 d測定鮮重，結果見圖4。

從圖4可以看出，臺灣相思、卷莢相思和黑木相思的懸浮細胞生長曲線具有相對一致性。細胞活躍生長期在第4～8天，鮮重迅速增長，細胞表現出強烈的分裂能力。到第8天時，鮮重增加3～4倍；8 d后，培養物鮮重的增長速度明顯下降，生長緩慢。同時還可發現，同樣的接種量卷莢相思的懸浮細胞增長速度明顯比臺灣相思和黑木相思快，黑木相思懸浮細胞的增殖量最小。而且卷莢相思和黑木相思懸浮細胞生長的周期也比臺灣相思長，在10 d后臺灣相思的懸浮細胞生長趨緩，卷莢相思和黑木相思的懸浮細胞系仍保持一定的增長量。所以，臺灣相思懸浮細胞培養周期以7 d繼代一次比較合適。卷莢相思和黑木相思懸浮細胞培養周期以8～10 d為宜。

2.7 相思樹懸浮細胞再生能力測定

選取培養多代后的相思樹懸浮培養液5 mL滴于固體培養基上進行培養，5 d后有肉眼可見的臺灣相思和卷莢相思小愈傷團出現，20 d后有大量的愈傷組織生成（圖版I-E、F、G），而黑木相思懸浮細胞再生速度較慢，10 d左右可見部分小愈傷團，25 d左右才能見愈傷組織大部分長成，生成愈傷組織的量也比臺灣相思和卷莢相思少，且有部分胚狀體的形成（圖版I-D、G）。這說明經過繼代多次的相思樹懸浮細胞系仍有很強的再生能力，但臺灣相思和卷莢相思懸浮細胞再生愈傷能力明顯比黑木相思強，這可能是由于黑木相思懸浮細胞較為分散，多由單細胞組成，但有一定胚狀體形成能力。而臺灣相思和卷莢相思懸浮細胞細胞團含量多，因此再生速度比黑木相思快。

2.8 相思樹懸浮細胞生長過程的細胞學觀察

將接在液體懸浮培養基MS+BA 1 mg/L+ NAA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L中的相思樹懸浮細胞，顯微鏡下觀察發現，3種相思樹細胞狀態各不相同（圖版I）：黑木相思在懸浮培養初期，懸浮培養中大部分為管狀細胞，少數為圓形胚性細胞，管狀細胞內含物較少，含有較大的淀粉粒，不具有分裂能力，在懸浮培養過程中逐漸死亡（圖版I-G、H）。而圓球形的細胞內含物豐富，具有較強分裂能力，在懸浮培養過程中經多次細胞分裂形成許多活力較強的小細胞團和球狀的單細胞。經過3～4次繼代懸浮培養后，管狀細胞逐漸消失，被球狀的單細胞和小型不同所替代。而臺灣相思和卷莢相思細胞較大，培養初期細胞系主要由一些較大的細胞團組成；由于外部的振蕩力及細胞本身的分散力，隨著培養時間的延長，細胞系中細胞團變少，游離的單個細胞逐漸增多，這些單細胞個體較大，形狀有圓形、長形和不規則形，細胞質分布不均（圖版I-I、J）。繼續培養細胞發生分裂，由一個細胞來源的多細胞通常粘連在一起形成許多小的細胞團（圖版I-K、L）。

3 討論

3.1 相思樹懸浮細胞系建立的關鍵因素

相思樹基因型和愈傷組織類型的選擇，是建立懸浮細胞系的關鍵因素。相思樹基因型的不同，細胞大小不一致，對養分、外界環境的感應不一致，使得懸浮培養在各方面均形成較大的差異。黑木相思細胞小，胚性強，分散性好，最容易建立起懸浮細胞系。卷莢相思由于其細胞相對較大，細胞的分散性好，粘連性低，在液體培養基的振蕩培養下，細胞結果2次懸浮繼代，就可以建立相對分散的懸浮細胞系。同時卷莢相思細胞內含物相對臺灣相思少，細胞滲透壓底，在高濃度的蔗糖的影響下更容易導致細胞的褐化死亡等現象。

用于建立懸浮細胞系的愈傷組織要求分散性好、增殖快、再生能力強，一般來說其外觀呈乳白色或淡黃色， 松散易碎[14-15]。鄧素芳等[16]、葉玲娟等[17]已經在朱砂根與相思樹等研究表明，由外植體誘導來的愈傷組織往往有多種類型， 選擇合適的愈傷組織類型或將已獲得的愈傷組織進行巧妙的繼代得到松散的胚性愈傷組織至關重要。本試驗中選擇淡黃色、質地鮮嫩松脆的愈傷組織作為相思樹懸浮培養的材料，在培養過程中，本研究也發現這些愈傷組織均能較快地建立起懸浮細胞系，同時，黑木相思愈傷組織還具有較強的胚性能力，因此在懸浮培養過程中就能發現綠色胚狀體的形成。而臺灣相思和卷莢相思愈傷組織經過懸浮系的選擇后，均具有較強的增殖能力。

3.2 影響相思樹懸浮細胞生長的主要因素

起始接種密度、蔗糖濃度及2，4-D濃度影響相思樹懸浮細胞生長。適宜的起始接種密度，可有效促進細胞的增殖，保持細胞一定的長勢，但隨著接種量的增加，細胞對養分的需求量也增大，在養分減少的同時，細胞的生長增殖能力也隨之下降。賴鐘雄等[18]、毛艷萍等[19]、蘇齊珍[20]、張云竹等[21]研究均發現適宜的接種密度利于懸浮細胞的生長。本研究發現，卷莢相思和臺灣相思懸浮細胞因其生長迅速，可選擇每瓶的接種量為0.3 g；黑木相思懸浮細胞生長緩慢，細胞增殖率小，每瓶接種量以0.5 g來保持懸浮細胞系。如果為較快獲得懸浮細胞，可將接種量增加至1.5 g左右。

一定的蔗糖濃度有利于懸浮細胞的生長，但是蔗糖濃度太高或太低都會降低懸浮培養中單細胞的分離率，這可能由于高滲透條件減緩了懸浮細胞的生長速度，促進分化而使分散性降低，從而影響懸浮細胞的生長質量，導致細胞內含物的減少，細胞趨向死亡[18]。當培養基中蔗糖濃度太低時，無法滿足提供細胞生長的足夠的養分，造成細胞的死亡，而在高濃度的蔗糖環境會形成由于高滲透壓環境，抑制細胞對培養基中其他營養物質的吸收。這與姬明[5]、李紅等[22]、高晗等[23]、趙倩等[24]研究蔗糖對懸浮細胞培養影響的觀點一致。本研究發現，30 g/L的蔗糖最有利于相思樹懸浮細胞狀態的保持。這與賴鐘雄等[18]研究龍眼懸浮細胞系中蔗糖對懸浮細胞系的保持是一致的。

2，4-D濃度對愈傷組織懸浮細胞的影響均較明顯。不同2，4-D濃度水平，細胞呈不同的狀態，過高濃度的2，4-D易導致懸浮細胞褐化、粘連，不利于建立穩定分散的懸浮細胞系。適宜濃度的2，4-D濃度有利于懸浮細胞的增殖及胚性的保持。

3.3 不同種類相思樹懸浮細胞生長過程細胞形態學的變化

不同種類（基因型）的相思樹懸浮細胞，其細胞生長狀態各不相同，通過懸浮細胞組織細胞學觀察，本研究可觀察到，黑木相思懸浮細胞大小各異，其含有的圓形細胞內含物多且具有很強的分裂能力。而臺灣相思和卷莢相思懸浮系細胞多為圓形，但內含物少，呈液泡狀，多為小團狀。這就使得不同基因型相思懸浮細胞在培養后期分裂的能力和方向不同。黑木相思形成愈傷組織的能力比卷莢相思和臺灣相思弱，但黑木相思圓形懸浮細胞內含物多，具有分化能力，能進一步分化成胚狀體。

參考文獻

[1] 陸道調， 吳保國， 王希群， 等. 相思樹研究發展綜述[J].福建林學院學報， 2004， 24（1）： 92-96.

[2] 孫敬三， 桂耀林. 植物細胞工程實驗技術[M]. 北京： 科學出版社， 1995.

[3] 袁力勇， 李紹清， 李陽生， 等. 水稻懸浮細胞系的建立[J]. 云南大學學報（自然科學版）， 2003， 25（4）： 373-376.

[4] 林珊珊. 相思離體培養與人工種子制作[D]. 福州： 福建農林大學， 2005.

[5] 姬 明. 黑木相思離體培養與再生系統的建立[D]. 福州： 福建農林大學， 2005.

[6] 葉玲娟. 相思樹的細胞培養及體胚發生研究[D]. 福州： 福建農林大學， 2008.

[7] 黃敬文， 蔣 晶. 黑荊樹懸浮單細胞低溫馴化[J]. 林業科學研究， 1989， 2（5）： 442-446.

[8] 黃敬文， 蔣 晶. 低溫馴化的黑荊樹懸浮培養細胞中可溶性蛋白質含量變化[J]. 林業科學研究， 1993， 6（6）： 661-665.

[9] Vengadesan G， Ganapathi A， Anbazhagan V R， et al. Somatic embryogenesis in cell suspension cultures of Acacia sinuata （Lour.） Merr[J]. Vitro Cellular & Developmental Biology Plant， 2002， 38（1）： 52-57.

[10] Arumugam S， Chu F H，Wang S Y et al. Establishment of an efficient cell suspension culture in Acacia confusa （Merr.） for induction of antioxidants by using elicitors[J]. Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology， 2010， 11 （1/4）： 17-30.

[11] Hustache G， Barnoud F， Joseleau J P. Callus formation and induction of a cell suspension culture from Acacia senegal[J]. Plant Cell Reports， 1986， 5（5）： 365-367.

[12] Gantait S， Kundu S， Das P K. Acacia： An exclusive survey on in vitro propagation[J]. Journal of the Saudi Society of Agricultural Sciences， 2016， 17（2）： 163-177.

[13] Vengadesan G， Ganapathi A， Amutha S， et al. In vitro propagation of Acacia species—a review[J]. Plant Science， 2002， 163（4）： 663-671.

[14] 郝艷芳， 王良群， 劉 勇， 等. 高粱幼葉細胞懸浮系的建立[J]. 作物雜志， 2018（1）： 35-40.

[15] 王胡軍. 東北紅豆杉懸浮細胞放大培養研究[D]. 長春： 吉林大學， 2017.

[16] 鄧素芳， 楊 旸， 賴鐘雄. 朱砂根愈傷組織培養及懸浮細胞系建立[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 2012， 20（1）： 33-38.

[17] 葉玲娟， 賴鐘雄， 蘇齊珍， 等. 相思樹的愈傷組織培養及其組織細胞學觀察[J]. 中國農學通報， 2009， 25（16）： 39-44.

[18] 賴鐘雄， 陳振光. 龍眼胚性細胞懸浮培養再生植株[J]. 應用與環境生物學報， 2002， 8（5）： 485-491.

[19] 毛艷萍， 蘇智先， 胡進耀. 瀕危植物珙桐愈傷組織的誘導及懸浮細胞培養初探[J]. 武漢植物學研究， 2010， 28（4）： 510-515.

[20] 蘇齊珍. 相思樹（Acacia spp.）若干種類的離體培養及其內源激素變化研究[D]. 福州： 福建農林大學， 2009.

[21] 張云竹，鐘秋平. 接種量與通氣比對印楝懸浮細胞生長及印楝素產量的影響[J]. 貴州農業科學， 2015，43（6）： 77-79.

[22] 李 紅， 鄺炎華， 彭新湘. 主要營養成分對甘蔗葉懸浮細胞生長影響的研究[J]. 華南農業大學學報（自然科學版）， 2002， 23（2）： 40-43.

[23] 高 晗， 陳發菊， 王毅敏， 等. 楸樹胚性組織懸浮系的建立和植株再生[J]. 基因組學與應用生物學， 2018， 37（3）： 895-899.

[24] 趙 倩， 林景衛， 馮雅萍. 紫茉莉懸浮細胞培養體系的建立[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 2013， 2l（5）： 453-458.