高效液相色譜的應用及展望

趙昌永

一、高效液相色譜的發展史

1.HPLC的前奏和萌芽

1903年，俄國植物學家茨維特（Tsweet）發表了“一種新型吸附現象及在生化分析上的應用”的研究論文，文中第一次提出了應用吸附原理分離植物色素的新方法。稱之為色譜法。

馬丁（Matin） 和辛格（Synge）用一根裝滿硅膠微粒的色譜柱，成功地完成了乙酰化氨基酸混合物的有效分離，建立了液液分配色譜方法。

2.HPLC的建立和逐步完善

第一屆液相色譜會議1973年在瑞士的因特拉肯舉行，現在則稱之為HPLC73。哈恩和漢卡克以及他們的同事于1975年開創了生物高分子分離。

我國于70年代初，科學院大連化學物理研究所就開展了HPLC的研究，與工廠合作生產出了液相色譜固定相，并出版了論文集，編寫了高效液相色譜講義。

二、高效液相色譜分類、特點、原理、系統

1.高效液相色譜的分類及特點

高效液相色譜可依據溶質（樣品）在固定相和流動相分離過程的物理化學原理分為五大類：

一是吸附色譜，二是分配色譜，三是離子色譜，四是體積排阻色譜，五是親和色譜。

高效液相色譜具有以下特點：

一是分離效能高。由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色譜填充柱的柱效達2×103～5×104/m理論塔板數。

二是選擇性高。由于液相色譜具有高柱效，并且流動相可以控制和改善分離過程的選擇性。因此，高效液相色譜不僅可以分析不同類型的有機物和同分異構體，還可分析在性質上極為相似的旋光異構體。

2.高效液相色譜的原理及系統

高效液相色譜法是在經典液相色譜法基礎上發展起來的。高效液相色譜法是在高壓條件下溶質在固定相和流動相之間進行的一種連續多次交換的過程，它借溶質在兩相間分配系數、親和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差別使不同溶質得以分離[4]。

高效液相色譜的系統：

高效液相色譜儀的主要部件有：貯液罐、高壓輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器等。其基本的工作流程是：貯液罐中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相中，被流動相載入色譜柱內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程后，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式打印出來。

三、高效液相色譜在各方面的應用

高效液相色譜適于分析沸點高、分子量大、熱穩定性差的物質和生物活性物質，它們約占全部有機化合物的80%。現在高效液相色譜已在制藥業研究中、食品工業分析中、環境監測、精細化工產品分析和生物化學及生物工程中獲得廣泛的應用。

1.在藥業研究中的應用

高效液相色譜在藥物分析中，主要考慮試樣的預處理和分析柱、檢測器的選擇，在試樣的預處理上，日前興起的固相（微）萃取使得許多含量低的成分得到精制提純，從而適于高效液相色譜[5]的測定。

青霉素有效成分的分離可采用反相鍵合相色法。色譜柱為Partisil-10 ODS，流動相：0.25摩爾每升碳酸銨水溶液，流量1.43毫升每分鐘。生物堿是從植物中提取獲得的含氮有機化合物，其種類繁多，大多數具有特殊的鎮痛生理作用，已在臨床上廣泛使用。

2.在食品工業分析中的應用

黃曲霉素是貯存時由真菌產生的毒素，它們是一類稠環類固醇化合物，有致癌作用。花生中的黃曲霉素可用正相吸附色譜分析，分析前，樣品先用甲醇、氯仿、己烷、丙酮和乙酸乙酯等溶劑，經機械震蕩30分鐘進行浸泡，經濃縮、精制后進行分析。色譜柱為硅膠，流動相為氯仿和二氯甲烷，流量為0.5毫升每分鐘。使用熒光檢測器檢測，激發波長為365 nm，發射波長為408 nm[6]。

食品中糖含量是產品質量控制的一個指標。糖類可以分為單糖、寡糖和多糖，它們可以用離子交換柱或氨基鍵合相柱進行分離。色譜柱為胺丙基硅膠柱，流動相為75%乙氰水溶液；流量為2.0 mL/min。用UVD（188 nm）進行檢測。

食品中的有機酸和酸味劑是食品酸味和鮮味的重要成分，也對食品的防腐起到重要作用。其中，咖啡酸及其衍生物可用反相鍵合相色譜進行分離。色譜柱為Li SI-C18 ，流動相為20%乙酸水溶液，流量為4.5 mL/min，用UVD檢測。

3.在環境監測中的應用

高效液相色譜在環境監測中已得到廣泛應用。EPA列出11項酚類化合物。均是焦化、染料、造紙、化工等工業廢水的主要衍生物，污染范圍很廣，對環境危害極大。HPLC測定酚類化合物，可以保持酚類化合物組成不變，對各種不同取代基及不同結構的酚類可以同時進行分離和分析，且具有重現性好、靈敏度高、選擇性好的優點。

4.在精細化工產品分析中的應用

在精細化工生成中使用的具有較高分子量和較高沸點的有機物，如高碳數脂肪族或芳香族的醇、醚、醛和酮、酸等化工原料，以及各種表面活性劑、藥物和染料等，都可以使用高效液相色譜進行分析。

使用凝膠滲透色譜柱分析聚乙二醇，色譜柱為AD-803/S，流動相為二甲基甲酰胺，流量1.0毫升每分鐘，柱前壓為1.0 Mpa，柱溫為62℃，用示差折光檢測器檢測。

5.在生物化學及生物工程中的應用

當前隨著生命科學和生物工程技術的迅速發展，人們對氨基酸、多肽等生物分子的研究興趣日益增加。這些生物活化分子是人類生命延續過程必須攝取的成分，也是生物化學、生物工程中重要研究對象。

四、高效液相色譜的展望

高效液相色譜法是吸納了經典液相色譜法和氣相色譜法的優點進行改進和發展起來的現代分析方法，具有分離速度快，測定效率高，重現性好的特點。目前指紋圖譜已成為國際公認的控制中藥或天然藥物質量的最有效手段。國外也運用HPLC聯用技術在植物藥鑒別中。同時也是探索人類基因組DNA序列變異的新手段。可以預計，隨著研究工作的深入，高效液相色譜必將很快成為廣泛采用的新的色譜方法。