紅小豆中總黃酮含量的不確定度評估

蔡玉紅，張之鑫，宋志峰，魏春雁

（吉林省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，農業(yè)部農產品質量安全風險評估實驗室（長春），吉林長春130033）

紅小豆（Phaseolus angularis Adzukibean），別名赤小豆、紅豆、小豆，屬于豆科一年生草本植物，原產于我國喜馬拉雅山一帶，屬于高營養(yǎng)的雜糧，在我國各地廣泛種植，有悠久的栽培歷史[1]。隨著檢測水平的提高，醫(yī)學研究的深入，紅小豆在增進人們健康、體現(xiàn)“藥食同源”的功能方面越來越為人們所了解。紅小豆中的黃酮具有抗氧化功能，能夠很好的消除人體內的氧自由基，可以有效的阻止細胞的衰老[2]。查閱文獻得知，植物中總黃酮含量測定的方法有色譜法、紫外分光光度法[3]、分光光度法等[4]，常用的黃酮提取方法主要有超聲波輔助提取法、乙醇浸提法、微波加熱提取法[5]等，不同的測定和提取方法對黃酮含量測量結果有一定的影響。目前國際通用的檢測報告要包含不確定度的評估，不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結果相關聯(lián)的參數(shù)[6-8]。本文采用紫外分光光度法測定紅小豆中黃酮含量，并對測量結果不確定度分量逐一評估，探討了不確定度貢獻率較高的分量產生原因，提出改進意見，降低合成不確定度總量。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

紅小豆：市售；沒有產地標簽。

蘆丁對照品：質量分數(shù)為99.2%，中國藥品生物制品檢定所；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、乙醇、石油醚等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

T6新世紀紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；BT124S電子天平：中國賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；索氏提取器：上海那艾精密儀器有限公司；單標吸管、容量瓶：天津市天波玻璃儀器有限公司（A級）。

1.2 試樣制備與測定

1）待測樣品紅小豆真空干燥恒重后，用高速旋轉粉碎機研磨，通過40目篩，密封干燥備用。

2）準確稱取樣品3.0 g于索式提取器中（同時做8次重復），加入50mL石油醚溶液浸泡回流后[9-10]，倒出石油醚溶液，加入濃度70%乙醇溶液50mL浸泡回流，將合并提取液移入100mL容量瓶中，70%乙醇溶液定容。用5mL移液管吸取4mL該溶液于25mL容量瓶中，依次加入70%乙醇溶液5mL、5%NaNO2溶液5mL、10%Al（NO3）3溶液3mL、8%NaOH溶液5mL，搖勻，最后用70%乙醇溶液定容至刻度。靜置10min后在紫外分光光度計于510 nm波長處，測量試液的吸光度。代入回歸方程計算，得出紅小豆中總黃酮類化合物（以蘆丁計）的含量（mg/mL）[11]。

1.3 標準溶液的配制

準確稱取蘆丁對照品6.5mg于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，既得0.064 5mg/mL系列蘆丁儲備液。

1.4 標準溶液工作曲線繪制

用10mL單線刻度吸管，分別吸取儲備液0.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mL 于 25 mL 容 量 瓶 中 ，同1.2.2依次加入反應溶液搖勻定容，得到0.0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL 系列濃度標準溶液。與待測液相同條件下，以70%乙醇溶液做參比，測量蘆丁系列標準溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標，蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，繪制工作曲線，建立回歸方程[12]。

2 不確定度分析

2.1 建立數(shù)學模型

試樣中黃酮元素含量計算公式

式中：X為試樣中黃酮的含量，mg/g；C為待測溶液中蘆丁的濃度，mg/mL；V為試樣定容體積，mL；m為試樣取樣量，g；f為溶液稀釋倍數(shù)，25/4。

2.2 不確定度的來源

按照試驗過程逐步篩選可能對檢測結果產生影響的不確定度主要因素見圖1，包括，（1）制備待測液引入的不確定度，包括天平、量具和環(huán)境條件；（2）標準工作曲線引入的不確定度，包括購買的標準溶液、配制系列標準溶液所用量具及實驗員的熟練程度；（3）測定結果工作曲線擬合時引入的不確定度；（4）重復測定及儀器精密度引入的不確定度；（5）標物添加回收引入的不確定度；（6）操作人員的熟練程度和其他可能引入不確定度的因素均包含在擴展不確定度中。

圖1 不確定度來源與分析Fig.1 The sourceof uncertainty and analysis

2.3 不確定度分量評定

2.3.1待測液制備過程引入的不確定度urel（X制）

待測液制備過程包括試樣的稱量、提取和顯色定容3個步驟，期間使用了（0.1mg）天平、5mL移液管、25mL和100mL容量瓶。

2.3.1.1 試樣稱量引入的不確定度urel（X1）

萬分之一天平的示值不確定度，天平的計量證書指出，稱量誤差為±0.2mg，按矩形分布計算，則示值不確定度；稱量變動性（即稱量重復性）引入的不確定度

稱量帶來的不確定度為0.115 5mg

稱量帶來的相對不確定度

2.3.1.2 試樣提取、顯色、稀釋定容引入的不確定度urel（X2）

1）根據(jù)JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[13]規(guī)定計算，試樣提取、顯色、稀釋定容所用到的容量器具引入的不確定度見表1。

2）試樣提取用100mL的容量瓶定容，顯色、稀釋使用了5mL移液管和25mL容量瓶，該過程引入的相對不確定度計算如下：

表1 測定過程中容量器具引入的相對標準不確定度Tab le1 The relative standard uncertainty from glasscontainer during the determ ination

最終，待測液制備過程產生的不確定度為：

2.3.2 標準溶液引入的不確定度urel（X標）

標準溶液引入的不確定度包括購買的有證黃酮標準溶液及由此稀釋配制系列標準溶液過程中引入的不確定度。

2.3.2.1 購買的蘆丁標準品引入的不確定度urel（ρ1）

蘆丁的純度為99.2%，按均勻分布，則標準不確定度為

2.3.2.2 配制0.064 5mg/mL蘆丁標準儲備液引入的不確定度urel（ρ2）

1）稱量6.5mg標準物質引入的相對標準不確定度

2）配制儲備液使用100mL容量瓶1次，引入相對標準不確定度為

2.3.2.3 系列標準溶液配制的合成標準不確定度urel（ρ3）

配制系列濃度溶液用時分別使用10 mL吸管、25mL容量瓶各6次，由于在工作曲線的測量時平行測定3次，并設計了8次樣品重復，在此，不再重復評定。

則標準溶液引入的合成相對標準不確定度為：

2.3.3 標準曲線擬合產生的不確定度urel（X擬）

參照標準曲線擬合產生的不確定度評定方法[14]，對本文標準溶液各點測定3次，取平均值，系列標準溶液濃度與吸光度檢測結果及計算見表2。用最小二乘法進行擬合，建立直線方程y=10.65x+0.005；R2=0.999。

表2 標準曲線濃度－吸光度結果及計算Table2 The resultsand calculation of Standard solution concentration－fluorescence intensity

標準曲線擬合引入的不確定度為：

則標準曲線擬合引入的相對不確定度為：

2.3.4 重復性[14-16]、儀器精密度（穩(wěn)定性）引入的不確定度urel（X重）

本方法從樣品制備，提取顯色反應步驟復雜繁瑣，各環(huán)節(jié)的不確定度不易評定，可以通過樣品重復性和儀器平行性測定，綜合評定過程引入的不確定度分量。

準確稱取3.0 g紅小豆樣品8份，同1.2.2方法提取制備待測液，每份待測液分取3次于紫外分光光度計上測定，樣品重復性測定結果見表3。

表3 樣品重復測定（總黃酮）結果Table3 Determ ination resultsof sam ple

被測溶液吸光度平均值：0.034，代入公式，試樣中

樣品重復性引入的不確定度：

樣品重復性引入的相對不確定度：

樣品中總黃酮的平均含量：7.08mg/g。RSD：1.326%；標準偏差：0.093 88mg/g。

2.3.5方法回收率引入的不確定度urel（X回）

實驗中有黃酮提取不完全、顯色干擾及量具轉移損失等因素，需要測定方法的回收率[17]。根據(jù)樣品測定結果等量添加對照品，按（1.2.2）制備待測液于紫外分光光度計上測定，計算結果回收率為96%～100%。

方法回收率引入的不確定度：

2.4 試樣含量的合成標準不確定度

2.4.1 相對合成標準不確定度

相對合成標準不確定度為：

已知試樣含量7.08mg/g，所以，試樣含量的合成標準不確定度為：

2.5 擴展不確定度

2.6 檢測結果

2.7 不確定度分量影響比較

各不確定度分量的評定和比較，結果見圖2。

圖2 不確定度分量貢獻比較Fig.2 Comparison of contribution rate to theuncertainty component

3 討論

1）試驗采用Bottom-Up不確定度評定方法，方法精確，但計算繁瑣也容易引起分量遺漏或重疊，要求評定人員仔細認真，既不遺漏也不重復。2）采用紫外分光光度法測定總黃酮含量時，以70%乙醇作為溶劑提取，提取完全簡便。3）黃酮屬于有機大分子成分，測定過程中，提取、顯色及比色對測量結果影響較大，所以要通過評定準確度引入測量不確定度的量，判斷測量方法、測量條件是否合適。4）由圖2可知，最小二乘法擬和曲線引入的不確定度最高，可能是配制的標準曲線濃度范圍較寬，實驗中考慮初步判斷黃酮含量之后，再用濃度接近，范圍較窄的標準曲線進行測定。5）標準曲線配制和回收率引入的不確定度較高，對合成不確定度有一定的貢獻，熟練的試驗員改用精度較高的移液器可適量降低不確定度，樣品制備引入的不確定度對測量結果影響不大，可以忽略。

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收稿日期：2017-02-08