鹽酸利多卡因眼用凝膠中細菌內毒素檢測方法學驗證

周曉惠 張軍東

摘 要 目的：建立鹽酸利多卡因眼用凝膠中細菌內毒素檢查法。方法：按照中國藥典2015版四部 1143 細菌內毒素檢查法，確定鹽酸利多卡因眼用凝膠的有效稀釋濃度和細菌內毒素限值。結果：鹽酸利多卡因眼用凝膠經稀釋4倍后不干擾鱟試劑與細菌內毒素的凝集反應，其細菌內毒素均小于0.5 EU/ml。結論：本研究的方法簡便、準確、可靠，可用于鹽酸利多卡因眼用凝膠中細菌內毒素的檢查。

關鍵詞 利多卡因眼用凝膠 細菌內毒素 鱟試劑

中圖分類號：R944.15； R927.11 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2018）05-0073-04

Validation of the methods for testing bacterial endotoxin in lidocaine hydrochloride ophthalmic gel

ZHOU Xiaohui*， ZHANG Jundong

（Shanghai Haohai Biological Technology Co.， Ltd.， Shanghai 201613， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the detection of bacterial endotoxins in lidocaine hydrochloride ophthalmic gel. Methods： The valid dilution concentration and limit value of the gel for the detection of bacterial endotoxin were tested based on the Chinese pharmacopoeia 2015 edition （Volume 4）. Results： The gel sample with 4-fold dilution would not interfere with the agglutination reaction between tachypleus amebocyte lysate and bacterial endotoxins and the values of bacterial endotoxin were all less than 0.5 EU/ml. Conclusion： The established method is simple， rapid， reliable and feasible for the detection of the bacterial endotoxins in lidocaine hydrochloride ophthalmic gel.

KEY WORDS lidocaine hydrochloride ophthalmic gel； bacterial endotoxins； tachypleus amebocyte lysate

鹽酸利多卡因為酰胺類麻醉藥，臨床上已使用多年。將鹽酸利多卡因制成眼用凝膠為新型眼表麻醉用藥，起效快，眼部停留時間長，在眼科手術上有重要用途。為保證藥品質量，降低使用風險，本研究參考中國藥典2015年版四部1143細菌內毒素檢查法[1]及文獻[2-4]建立了鱟試劑檢查眼用凝膠的方法，簡便可行，結果滿意。

1 實驗材料與方法

1.1 儀器

Eppendorf微量取液器（50～1 000 ml）；QL-901型漩渦混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）； LRH-70生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；細菌內毒素檢查用具（廈門鱟試劑實驗廠）。

1.2 藥品與試劑

細菌內毒素檢查用水（廈門鱟試劑實驗廠，批號160702，每支2 ml）；細菌內毒素工作標準品（廈門鱟試劑實驗廠，批號160301，每支15 EU）；鱟試劑（廈門鱟試劑實驗廠，批號160306，靈敏度0.125 EU/ml）；鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號1511202，靈敏度0.125 EU/ml）；眼用凝膠（上海昊海生科自制，批號160101、160102、160103，規格5 ml/支）。

1.3 方法

1.3.1 細菌內毒素限值（L）的確定

參照中華人民共和國醫藥行業標準YY0861-2011眼科光學眼用粘彈劑細菌內毒素檢查限值為0.5 EU/ml[5]和《中國藥典》2015年版（四部）附錄0128沖洗劑細菌內毒素限制為0.5 EU/ml[1]，確定本品細菌內毒素檢查限值為0.5 EU/ml。

1.3.2 鱟試劑靈敏度復核

將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解，在漩渦混合器上混勻15 min，然后稀釋成2.0，1.0，0.5，0.25 λ（λ靈敏度標示值）4個濃度等級，按細菌內毒素檢查法[1]進行靈敏度復核試驗，靈敏度測定值λc均在0.5～2.0 λ之間，符合規定。

1.3.3 最大有效稀釋倍數（MVD）的確定

根據公式MVD=cL/λ[5]，式中L為供試品的細菌內毒素限值即0.5 EU/ml；c為供試品溶液的濃度，當L以EU/ml表示時，則c等于1.0 mg/ml；λ為主凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度，目前市售鱟試劑的λ通常為0.5 EU/ml，0.25 EU/ml，0.125 EU/ml，0.06 EU/ml，0.03 EU/ml，故鹽酸利多卡因眼凝膠的MVD分別為1、2、4、8和16倍。

1.3.4 干擾預實驗

將眼用凝膠用細菌內毒素檢查用水分別稀釋成1、2、4、8和16倍的溶液，測定pH值在6.0～7.0范圍內，符合細菌內毒素檢查的pH值要求，作為供試品陰性對照（NPC）系列。另制備同樣濃度的供試品系列溶液，使每一濃度的供試品溶液中都含有2 λ內毒素，作為供試品陽性對照（PPC）系列。用來自2個廠家靈敏度均為0.125 EU/ml的鱟試劑與上述NPC和PPC系列溶液進行反應，每一供試品濃度平行兩管，按常規設立陽性對照（PC）管和陰性對照（NC）管，混勻后封口，置37℃恒溫培養箱中反應60 min。

1.3.5 干擾試驗

為了最終確認是否存在抑制因素的影響，進行正式干擾試驗。取3批眼用凝膠用BET水分別稀釋為若干倍稀釋液，用該稀釋液和細菌內毒素檢查用水分別稀釋細菌內毒素工作標準品，配成細菌內毒素最終濃度分別為0.25（2 λ）、0.125（λ）、0.062 5（0.5 λ）、0.031 25（0.25 λ）EU/ml的系列溶液，與2個廠家的靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑反應，每個濃度平行做4管，另取供試品溶液平行2支，細菌內毒素檢查用水作為陰性對照，依法進行干擾試驗。

1.3.6 樣品的細菌內毒素檢查

取3批眼用凝膠按規定倍數稀釋，使用2個廠家靈敏度λ為0.125 EU/ml的鱟試劑，按中國藥典2015年版（四部）附錄細菌內毒素檢查法檢查。

2 結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核

對2個廠家的鱟試劑進行靈敏度復核，經細菌內毒素工作標準品檢測λc在0.5 ～2.0 λ之間，符合標準規定，可用于試驗（表1）。

2.2 干擾預實驗結果

眼用凝膠對鱟試劑與細菌內毒素之間的聚集反應無干擾，考慮到原液為凝膠狀，用微量移液器無法準確吸取，稀釋4倍后可準確吸取，因此選擇稀釋4倍為最終稀釋倍數。結果見表2。

2.3 干擾試驗

兩個廠家鱟試劑的Es均在0.5～2.0 λ（包括0.5 λ和2.0 λ）之間，且Et在0.5～2.0 Es（包括0.5 Es和2.0 Es）的范圍內（Es為用細菌內毒素檢查用水制成的細菌內毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值，Et為用供試品溶液制成的內毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值），表明稀釋4倍的供試品溶液對試驗無干擾，可在低于或等于此濃度的情況下使用細菌內毒素檢查法（表3）。

2.4 樣品中細菌內毒素檢測結果

3批眼用凝膠樣品稀釋4倍后進行細菌內毒素檢測，結果表明，3批樣品細菌內毒素檢測均小于0.5 EU/ml，符合規定（表4）。

3 討論

眼用凝膠稀釋后pH為6.0～7.0，符合細菌內毒素檢查供試液pH 要求標準，不干擾凝膠反應，無需調節可直接取供試品用BET 水稀釋。

干擾初篩試驗的目的是初步篩選出對檢查無干擾的樣品稀釋倍數范圍及相應的鱟試劑靈敏度，最終要經干擾試驗驗證，從表2結果初步判斷樣品2～16倍稀釋液對細菌內毒素檢查無干擾作用.理論上可選擇樣品2、4、8、16倍稀釋液中的任一溶液，采用相應靈敏度的鱟試劑進行干擾試驗，為了簡化樣品的稀釋操作步驟并使稀釋液能被準確量取，本試驗選擇稀釋倍數為4，用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進行干擾確證試驗。

表3干擾試驗結果顯示，3批樣品經稀釋4倍后，分別使用兩個不同廠家生產的鱟試劑（靈敏度均為0.125 EU/ml）進行試驗，其Et/Es均在0.5～2.0之間，按照中國藥典附錄細菌內毒素檢查干擾試驗項下的判斷標準，認為樣品在該稀釋倍數下不干擾細菌內毒素檢查.

根據實驗結果，確定眼用凝膠細菌內毒素檢查方法如下：將本品用細菌內毒素檢查用水稀釋4倍，依據中國藥典[1]附錄細菌內毒素檢查法進行檢查，細菌內毒素限值定為0.5 EU/ml.

參考文獻

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