YAP表達與肝細胞癌臨床特征及預后的關系△

王翊凱，畢新宇，趙宏，趙建軍，李智宇，周健國，黃振，張業繁，陳曉，吳曉龍，茅銳，周彥池，劉劍梅，蔡建強

國家癌癥中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院肝膽外科，北京1000210

原發性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）居全世界惡性腫瘤發病率第6位，病死率居第3位。在中國肝癌病死率高居第2位，每年全世界因肝癌死亡的患者有一半以上來自中國[1]。年齡、性別、乙肝病毒感染、黃曲霉毒素感染、長期酗酒和肝硬化等都是HCC的發病危險因素[2]。甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、腫瘤直徑、腫瘤數目、門靜脈癌栓等是目前用于評估肝癌預后的常見危險因素，但是這些指標預測肝癌患者術后遠期生存的效果有限[3-4]。因此，臨床上急需找到一些能有效預測肝癌術后復發和轉移的腫瘤標志物，通過標志物發現高復發和高死亡風險的肝癌患者并及時進行臨床干預。Yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）是Hippo信號通路下游的靶蛋白，在多種惡性腫瘤中呈異常表達和活化，并參與調控腫瘤細胞的增殖、侵襲、血管生成等多種生物學功能，因此YAP有可能成為一個新的腫瘤分子標志物[5]。本研究通過對98例HCC患者術后腫瘤組織切片進行免疫組化染色，分析肝癌組織中YAP的表達情況及其與肝癌患者臨床特征及預后之間的關系，探討YAP在肝癌中的表達差異是否可作為預測肝癌術后預后的分子指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月至2011年12月在中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院腹部外科收治的98例HCC患者的臨床資料，對98例HCC患者術后癌組織與癌旁組織的病理切片進行免疫組化染色。98例患者均接受了根治性切除術，術前均無遠處轉移，肝功能均為Child-Pugh A級，術后病理均證實為HCC，腫瘤分期按照2010年國際抗癌聯盟TNM分期標準[6]劃分。本研究取得了所有研究對象及家屬的知情同意。

1.2 試劑來源

YAP抗體購自Cellsignal公司，為兔來源的單克隆抗體。二抗為山羊抗兔/鼠IgG抗體-辣根過氧化酶（HRP）多聚體，購自DAKO公司。

1.3 免疫組化方法及評價標準

病理標本經10%中性甲醛固定，石蠟包埋連續切片，厚4 μm。石蠟切片常規脫蠟水化后，抗原修復[YAP預處理：枸櫞酸緩沖液（0.01 μmol/L，pH值為6.0），微波95～98 ℃，維持12 min]，免疫組化方法采用非生物素二步法，常規免疫組織化學染色程序進行染色。YAP一抗工作濃度為1∶80，二抗工作濃度為1∶50。DAB顯色，蘇木精復染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用已知染色強陽性的組織切片作為陽性對照，用山羊血清代替一抗作為陰性對照，PBS代替一抗作為空白對照。

免疫組化判斷結果主要根據陽性細胞在全部組織細胞中所占比例以及陽性細胞染色強度。采用半定量積分法，每張切片隨機選擇5個視野，每個視野高倍鏡下計數100個細胞。①染色強度評分標準：不著色0分，黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分；②陽性細胞所占比例評分標準：陽性細胞數≤5%者0分，6%～25%者1分，26%～50%者2分，51%～75%者3分，＞75%者4分。上述兩項評分相乘后，0分為陰性（－），1～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。以（+）為界點，（－）為YAP陰性組，（+～+++）為YAP陽性組。

1.4 臨床隨訪

本組所有患者在術后前3年內每3個月隨訪一次，3年后每半年隨訪一次。隨訪方式為門診復查、電話或上門隨訪，隨訪內容包括肝功能檢查、腫瘤標志物、胸部X線、腹部超聲檢查，對懷疑復發的病例行進一步的CT或MRI檢查。隨訪時間截至2017年1月，總生存期（overall survival，OS）和無進展生存期（relapse-free survival，RFS）分別指手術日到患者死亡和診斷為復發的時間，無終點事件的患者以隨訪截止時間為準。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法進行生存分析，并采用Log-rank進行檢驗；采用Cox比例風險模型進行單因素、多因素分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 YAP在肝癌組織、癌旁組織中的表達情況

YAP主要表達于腫瘤細胞核和細胞質中。本研究98例肝癌組織中，YAP陰性77例，YAP弱陽性11例，YAP陽性9例，YAP強陽性1例，YAP陰性率為78.6%（77/98），YAP陽性率為21.4%（21/98），YAP高表達率為10.2%（10/98）。（圖1）

2.2 YAP表達情況與肝癌臨床特征的關系

采用Pearsonχ2檢驗分析YAP表達水平與各臨床特征間的關系。不同臨床特征患者的YAP蛋白表達情況比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

2.3 預后影響因素的單因素分析

本研究共選取12項可能影響肝癌患者術后生存的臨床特征，包括患者年齡、性別、臨床癥狀、乙肝表面抗原、術前AFP水平、腫瘤直徑、腫瘤數目、有無肝硬化、大血管侵犯或存在瘤栓、腫瘤家族史、TNM分期和YAP表達狀態。單因素分析結果顯示，術前AFP水平、大血管侵犯或存在瘤栓、YAP表達狀態與患者術后RFS及OS有關（P＜0.05）。（表2）

2.4 預后影響因素的多因素分析

將上述單因素分析得出的3個影響患者術后預后的因素（AFP≥20 ng/ml、大血管侵犯或存在瘤栓、YAP表達陽性）帶入Cox回歸模型進行多因素分析，結果顯示AFP≥20 ng/ml、YAP表達陽性是影響患者術后RFS和OS的兩個獨立預后危險因素（P＜0.05）。（表 3）

圖1 YAP在肝癌中的表達（免疫組化染色，×400）

表1 YAP表達情況與HCC患者臨床特征的關系[ n（%）]

2.5 生存分析

根據YAP蛋白表達狀態繪制無復發生存曲線和總生存曲線。YAP陽性組、YAP陰性組的中位RFS分別為38.07、56.92個月，中位OS分別為54.43、63.43個月；YAP陽性組、YAP陰性組的3年無復發生存率分別為47.1%、84.2%，5年無復發生存率分別為41.2%、76.1%；YAP陽性組、YAP陰性組的3年總生存率分別為71.4%、87.0%，5年總生存率為57.1%、77.9%；YAP陽性組術后3、5年累積無復發生存率和總生存率均低于YAP陰性組（P＜0.05）。（圖2）

3 討論

手術是目前肝癌最有效的治療方法，但肝癌切除術后5年生存率并未顯著提高，研究發現術后高復發率是影響生存的主要原因。臨床上發現肝癌復發的患者，根據肝癌復發的特征，可以選擇再次手術切除、局部消融、經導管肝動脈化療性栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）、放療或系統治療等措施來延長患者的生存期。對于高危復發者，臨床研究證實術后TACE治療有一定的治療效果，TACE介入治療能發現并控制肝內微小殘癌[7]。此外，對于伴有門靜脈癌栓的患者，術后經門靜脈置管化療聯合肝動脈化療栓塞，也可明顯延長患者的生存期[8]。由此可見能夠早期發現高復發高死亡風險的患者并及時進行干預是延長患者術后生存期的關鍵[9]。目前臨床上簡單的臨床特征已經被證實難于進行有效的預測，如AFP是現在診斷肝癌和預測預后最常用的腫瘤標志物，但臨床上有40%的小肝癌患者AFP呈假陰性[10]。因此尋找更多可以預測肝癌預后的有效分子生物學指標具有重要的臨床意義。

表2 98例HCC患者術后RFS及OS影響因素的單因素分析

表3 98例HCC患者術后RFS和OS影響因素的多因素分析

圖298 例HCC患者無復發生存曲線和總生存曲線

YAP是Hippo信號通路的核心效應因子，在調控細胞增殖和凋亡及組織器官大小方面起著重要作用[11]。YAP異常表達與肝癌的發生、發展密切相關，可引起肝癌細胞的增殖、侵襲、轉移、凋亡、逃逸等一系列生物學行為[12]。研究報道YAP是人類原發乳腺癌、肺癌、胃腸道惡性腫瘤中明確的癌基因[13-15]。在乳腺癌中，YAP在癌細胞細胞質和細胞核中呈高表達，YAP的表達狀態可以預測乳腺癌患者術后的長期生存時間[16]。Liu等[17]報道YAP在膀胱移行上皮細胞癌中呈高表達狀態，并與癌細胞的增殖和侵襲密切相關，YAP可以作為膀胱癌的預后標志物。

本研究免疫組化染色結果發現，肝癌組織中YAP陽性表達率為21.4%，YAP高表達率為10.2%。文獻報道，YAP在肝癌患者中普遍表達。本研究中YAP表達率不高，可能與入組患者例數較少有關。Cox多因素分析證實YAP表達陽性是影響HCC患者術后RFS和OS的獨立危險因素。生存分析發現YAP陽性組與YAP陰性組的中位RFS分別為38.07、56.92個月，中位OS分別為54.43、63.43個月，提示YAP陽性表達的HCC患者預后較差。

惡性腫瘤最大的特點是腫瘤細胞無限制地分裂，從而引起腫瘤的惡性增殖和進展[18]。研究發現，YAP與TEAD轉錄因子結合后發揮促癌作用，YAP過表達代表調節細胞增殖分化、抗凋亡、負責細胞存活轉移的一組靶基因（CTCG、CCND1、ITGB2、BIRC5/survivin、BCL2L1、Ki-67、c-myc、AFP）的異常激活，尤其是與細胞增殖和腫瘤進展密切相關的基因（TEAD1和TEAD4）的異常激活[11,19-20]。此外，YAP還能抑制一些抑癌基因的表達，如DDIT4和Trail的表達，這些抑癌基因可以改變細胞的生物學行為，比如抑制增殖和侵襲行為，刺激血管再生等[21]。在細胞水平的研究中證實，過表達的YAP與上皮間充質轉化（EMT）、錨定非依賴性生長等致癌特性密切相關，YAP與TEAD1共同調節EMT轉錄因子Zeb1，促進細胞增殖和EMT，減弱細胞間的緊密連接，從而增強腫瘤細胞的遷移侵襲能力，從而與肝癌的高復發特性具有顯著相關性[22]。本研究中YAP與HCC術后中位RFS和OS有關，與以上研究報道結果相符。本研究中YAP表達狀態與術前AFP水平、腫瘤直徑、腫瘤多發、肝硬化等病理因素無關，考慮為納入研究的例數較少引起。

Cox單因素分析表明，影響肝癌預后的因素包括術前AFP水平、大血管侵犯或存在瘤栓、YAP表達狀態。而腫瘤直徑、腫瘤數目、肝硬化、TNM分期這4個文獻中多次報道的影響肝癌預后的有效指標，本組研究未得出顯著意義，考慮為98例患者例數較少且只有3例Ⅲ～Ⅳ期患者的原因。YAP陰性組患者的術后無復發生存率和總生存率高于YAP陽性組；YAP陽性組、YAP陰性組的3年無復發生存率分別為47.1%、84.2%，5年無復發生存率為41.2%、76.1%；YAP陽性組、YAP陰性組3年總生存率分別為71.4%、87.0%，5年總生存率為57.1%、77.9%，提示YAP參與了肝癌惡性生物學行為，促進肝癌的病情進展。更重要的是Cox多因素分析表明，YAP陽性表達、術前AFP≥20 ng/ml是影響肝癌術后預后的獨立危險因素，而且在Cox多因素回歸模型中YAP陽性表達在影響肝癌預后諸因素中權重較大，提示YAP對肝癌術后預后具有較好的預測價值。

綜上所述，YAP陽性組患者術后的RFS和OS降低，YAP陽性表達是HCC患者術后預后的獨立危險因素，YAP可以成為HCC診斷和術后預后的預測指標，針對YAP的靶向藥可能成為HCC新的治療方式。同時，本研究也有樣本量小和回顧性分析固有的偏倚存在，有待更多中心更大樣本量的研究來驗證。

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