microRNA-376c在人結直腸癌組織中的表達水平及其與臨床特征和預后的關系

袁偉，馬肖，馬潔

1國家癌癥中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 100021

2北京醫院生物治療中心/國家老年醫學中心，北京 100730

結直腸癌是常見的惡性消化道腫瘤，中國結直腸癌的發病率和病死率在全部惡性腫瘤中均居前5位[1]。晚期結直腸癌患者的術后5年總生存率仍不理想，僅有15%[2]。尋找預測結直腸癌進展及預后的標志物對結直腸癌患者的個體化治療以及延長患者的生存期具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）已被證明幾乎參與腫瘤發生、發展的各個階段，并且可以作為預測腫瘤患者病情進展及預后的標志物[3]。在本研究組的前期研究中利用miRNA芯片在結直腸癌組織及相應的癌旁正常組織中篩選出多個差異表達的miRNA，并且發現這些miRNA與結直腸癌患者的臨床分期、淋巴結轉移、預后相關[4-7]，其中包括miRNA-376c。miRNA-376c屬于miRNA-376家族成員，定位于人類14號染色體長臂32區，已被證實參與多種腫瘤，如骨肉瘤、肺癌、宮頸癌、口腔癌的發生發展過程[8-11]，如通過抑制靶基因TGFA，進而抑制骨肉瘤細胞的增殖和侵襲[8]，通過靶向BMI1抑制口腔癌細胞的增殖、遷移，并促進其凋亡[11]。miRNA-376c的表達水平與口腔癌患者的臨床特征，如TNM分期、分化程度以及淋巴血管侵犯相關，提示其可作為預測口腔癌患者病情進展的標志物[11]。然而miRNA-376c在結直腸癌中尚未有研究，其在結直腸癌組織中的表達水平尚未明確。本研究使用實時熒光定量PCR的方法驗證了202例結直腸癌組織及相應癌旁正常組織中miRNA-376c的表達水平，并分析其與結直腸癌患者臨床特征的關系以及與患者預后的關系，初步提示miRNA-376c有可能作為預測結直腸癌患者病情進展以及預后的標志物。

1 材料與方法

1.1 標本采集

本實驗所用的組織標本均來自2011年3—12月于中國醫學科學院腫瘤醫院接受治療的202例結直腸癌患者，術中取患者的新鮮結直腸癌組織標本及相應的癌旁正常組織標本，采集后立即放入液氮中冷卻，于-80℃冰箱保存。所有患者均經病理檢查確診為結直腸癌，且患者手術前均未接受化療或放療。202例患者中，男117例，女85例；年齡﹤60歲98例，≥60歲104例；腫瘤直徑﹤5 cm 104例，≥5 cm 98例；腫瘤位置：結腸92例，直腸110例；分化程度：高分化10例，中分化172例，低分化20例；有淋巴結轉移99例，無淋巴結轉移103例；TNM分期：Ⅰ期35例，Ⅱ期66例，Ⅲ期83例，Ⅳ期18例。按照有無淋巴結轉移，將結直腸癌組織分為A組（癌伴淋巴結轉移，n=99）和B組（癌無淋巴結轉移，n=103），將癌旁正常組織分為C組（癌旁伴淋巴結轉移，n=99）和D組（癌旁無淋巴結轉移，n=103）。本研究獲得本院倫理委員會批準（批號為NCC2013-093），所有患者均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

miRNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、定量PCR試劑盒、miRNA-376c和內參照U6的特異性引物均購自德國Qiagen公司。

1.3 miRNA的提取和檢測

miRNA的提取嚴格按照miRNeasy mini試劑盒的操作步驟進行。提取結直腸組織總RNA，應用紫外分光光度計檢測提取的miRNA的濃度和純度，根據RNA濃度計算用于逆轉錄實驗的RNA體積。按照Qiagen逆轉錄試劑盒說明書將總RNA逆轉錄成cDNA，反應條件為37℃60 min、95℃5 min。取逆轉錄產物為模板，利用Qiagen定量PCR試劑盒、miRNA-376c和內參照U6的特異性引物，按照說明書中的反應體系進行實時定量PCR檢測，所有反應均設置3個復孔。反應條件為95℃15 min，94℃ 15 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，共45個循環。采用Lightcycler 480實時定量PCR儀進行檢測，以U6為內參照計算相對表達水平，反應體系中熒光信號達到閾值的循環數為Ct，相對表達量以-△Ct來表示，計算公式為-△Ct=CtU6-CtmiRNA-376c。-△Ct值越高表明miRNA-376c相對表達量越高。

1.4 隨訪情況

采用電話的方式對患者進行術后隨訪，隨訪截止時間為2015年9月12日，隨訪時間為5～45個月。202例患者中，156例患者獲得有效隨訪，隨訪率為77.2%。

1.5 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，多組間任意兩組比較采用LSD-t檢驗；計數資料以率（%）表示，組間比較采用交叉表分析。生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-376c在不同組織中的表達情況

實時熒光定量PCR結果顯示：miRNA-376c在結直腸癌組織中的相對表達量為（-10.918±0.101），明顯低于癌旁正常組織的（-9.700±0.103），差異有統計學意義（t=8.50，P﹤0.01）。方差分析結果顯示：A、B、C、D四組中miRNA-376c的相對表達量比較，差異有統計學意義（F=28.22，P﹤0.01）；其中，A組中miRNA-376c的相對表達量明顯高于B組[（-10.620±0.136）vs（-11.230±0.143）]，差異有統計學意義（P﹤0.01），詳見圖1。miRNA-376c在Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期結直腸癌組織中的相對表達量逐漸升高，分別為（-11.230±0.143）、（-10.790±0.147）、（-9.848±0.300），差異有統計學意義（F=8.22，P﹤0.01），詳見圖2；而miRNA-376c在不同分期患者的癌旁正常組織中的相對表達量比較，差異無統計學意義（P﹥0.05）。

圖1 miRNA-376c在結直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達水平

圖2 miRNA-376c在不同分期患者結直腸癌組織中的表達水平

2.2 miRNA-376c表達水平與結直腸癌患者臨床特征的關系

以miRNA-376c在結直腸癌組織中表達水平的中位數（-11.08）為截點，將202例患者分為miRNA-376c高表達組（n=101）和miRNA-376c低表達組（n=101）。miRNA-376c在結直腸癌組織中的表達與結直腸癌患者的分化程度、淋巴結轉移、TNM分期均有關（P﹤0.05），其中高表達miRNA-376c的結直腸癌患者的分化程度低、淋巴結轉移率高、TNM分期較差。而miRNA-376c在結直腸癌組織中的表達與結直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤部位及腫瘤大小無關（P﹥0.05）。（表1）

2.3 miRNA-376c表達水平與結直腸癌患者預后的關系

Kaplan-Meier生存分析顯示：miRNA-376c高表達組和低表達組患者術后隨訪45個月的生存率分別為75.64%和89.74%；miRNA-376c高表達組患者的總生存期明顯短于miRNA-376c低表達組，差異有統計學意義（χ2=5.61，P﹤0.05）。（圖3）

3 討論

miRNA被證明在腫瘤的發生、發展中扮演著重要角色，并且可以作為腫瘤的早期診斷、靶向治療以及預后的潛在標志物。以往的研究表明，miRNA-376c在不同的腫瘤中發揮著不同的作用，如在骨肉瘤、肺癌、宮頸癌以及口腔癌中miRNA-376c表達下調，并且可以作為抑癌基因抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲等生物學特性[8-11]。同時，在頭頸鱗癌、前列腺癌以及胃癌組織中miRNA-376c表達上調[12-14]，并且可以作為促癌基因促進頭頸鱗癌和前列腺癌細胞的轉移[12-13]。

表1 miRNA-376c表達水平與結直腸癌患者臨床特征的關系[n（%）]

圖3 miRNA-376c高表達與低表達結直腸癌患者的生存曲線

miRNA-376c在結直腸癌中尚未有研究報道，其在結直腸癌中的表達以及能否參與結直腸癌患者的病情進展尚不可知。本研究檢測了202例結直腸癌患者的結直腸癌組織以及相應的癌旁正常組織中miRNA-376c的表達水平，并發現了高表達水平的miRNA-376c與結直腸癌患者的高TNM分期、低分化、淋巴結轉移以及不良預后相關，這表明miRNA-376c可能在結直腸癌的發展過程中起到了促癌作用。但miRNA-376c在結直腸癌組織中的表達水平低于癌旁正常組織，說明其在結直腸癌發生的早期階段可能又起到了抑癌基因的作用。這種角色的轉變可能是由于其在不同的階段作用的下游靶基因不同而造成的。目前，已證實的miRNA-376c的靶基因有TGFA、LRH-1、RUNX2、MMP2和ARID4A等[8-9,12-14]，分別參與不同腫瘤細胞的增殖和侵襲過程。MiRNA-376c在結直腸癌的發生、發展階段可能作用于不同的靶基因，其機制有待以后進一步探討。

miRNA被認為能夠與一些常用的標志物（如CA19-9）聯合用于腫瘤的早期診斷，這在本研究組的前期研究結果中也有報道[15]。miRNA-376c在胃癌患者的血漿中表達上調，表明其可能作為診斷早期胃癌的潛在標志物[14]。miRNA-376c在結直腸癌患者血漿中的表達情況有待進一步驗證。

綜上所述，在結直腸癌的不同發展階段，miRNA-376c的表達水平不同，并且其與結直腸癌患者的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移以及預后相關，提示miRNA-376c有可能作為指示結直腸癌患者病情進展的標志物。

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