利用枯草芽孢桿菌發酵魷魚內臟的工藝探討

李 怡，魏薇薇，聞正順

（浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山 316022）

微生物發酵技術得益于其條件溫和，充足的原產物來源，以及價格低廉、專一的產物、還有對環境污染小等特點，使得微生物發酵在諸多領域應用廣泛，比如在食品工業、醫藥工業、農業、環境保護等方面。形成了規模較大的發酵工業。在很多發達國家，國民生產總值的百分之五左右為發酵工業[1]。查閱相關文獻可知，纖維素酶、植酸酶、蛋白酶、果膠酶、葡聚糖酶、淀粉酶和木聚糖酶約十幾種酶類枯草芽孢桿菌都可以產生[2]。枯草芽孢桿菌屬于一種安全菌株，美國食品藥品監督管理局調查發現枯草芽孢桿菌的使用無安全隱患的存在。美國有關部門已經批準將其作為飼料的成分去飼養動物。我國農業部也允許將枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑[3-4]。

隨近年來捕撈技術的改進，我國魷魚的捕撈量也隨即增加。在魷魚的處理過程中會產生大部分的廢物，魷魚內臟就占其中的很大比例，雖然是魷魚加工過程中產生的廢物，但是其所含營養卻是相當豐富的，光魷魚內臟所含的蛋白質就達到了百分二十左右，脂肪含量和蛋白質相當。除此之外，還富含人體所需的氨基酸、牛磺酸以及一些微量元素，因此將魷魚內臟進行加工處理后再投放市場能達到不錯的經濟效益，還能夠緩解因魷魚加工所產生的大量廢物帶來的環境壓力。據了解，目前把魷魚內臟加工制作成飼料的較多，因為其含有豐富的氨基酸。另外，也將魷魚內臟制成醬油和天然調味品等[5]。但在我國，讓消費者接受內臟產品是一個不小的挑戰[6]，在我國將魷魚內臟做成醬油的研究比較多，段杉等[7]、徐偉等[8]在這方面做了不少研究工作。早在上個世紀末就有學者發現研究魷魚內臟具有很大的市場價值[9]，國外學者SATOH et al[10]研究發現魷魚內臟作為飼料對黑巖魚具有很好的飼養效果。利用枯草芽孢桿菌產生的酶類發酵魷魚內臟下腳料，將蛋白質降解為小分子肽類，其可作為魚飼料的輔助添加劑，也可混以其他物質作為農作物肥料，易被吸收[11]。試驗通過研究枯草芽孢桿菌發酵魷魚內臟的工藝優化，用魷魚內臟作為發酵底物，測定發酵液中的可溶性肽含量來衡量發酵效果，目的是為了提高魷魚內臟的高值化利用以及為今后用枯草芽孢桿菌發酵海產品下腳料提供可供參考的文獻資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與培養基

枯草芽孢桿菌（保存于實驗室），菌種擴大培養基為：葡萄糖（碳源）、蛋白胨、酵母浸粉、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、無菌水。發酵培養基組成為魷魚內臟，無菌水，碳源。

1.1.2 主要試劑

Na2CO3、NaOH、無水CuSO4、酒石酸鉀鈉等試劑。（均為分析純）

1.2 儀器與設備

UV-1600型紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；THZ-82B氣浴恒溫震蕩器，金壇市醫療儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；DGG-9140A型電熱鼓風恒溫干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；YC-260L 4℃冰箱，中科美菱；FA1004N分析天平，上海民橋精密科學儀器有限公司；TG20-WS離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司等。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的擴大培養

根據1.1.1配方按比例制作枯草芽孢桿菌擴大培養基，制備好后放入滅菌鍋中121℃滅菌30 min，滅菌完成后于超凈工作臺中冷卻至室溫，用接種環挑取保存于斜面的菌種一環接種于擴大培養基中，進行擴大培養，得到種子液，保存備用。

1.3.2 發酵工藝

將保存在冰箱的下腳料流水解凍后稱取2 g作為發酵底物，然后加入一定比例的無菌水和碳源，最后將擴大培養的發酵種子液在無菌環境下接種到下腳料底物中進行單因素以及正交試驗。發酵結束后利用福林酚法測定發酵液中可溶性肽的含量，并計算出結果。

1.3.3 單因素試驗設計

在確定單因素水平之前做預實驗，選取多個水平進行單因素試驗，通過試驗結果分析確定最后的各個因素水平范圍，試驗將選取碳源添加量、菌種接種量、料水比以及培養時間這4個因素作為試驗的單因素，根據發酵液中可溶性肽含量來判斷各因素對發酵效果的影響[12]。

1.3.4 正交試驗設計

正交試驗設計建立在前期單因素試驗結果上，分析各因素對發酵效果的影響大小選取碳源接種量、料

表1 正交試驗設計Tab.1 Orthogonal experimental design

水比例、菌液接種量此三因素來設計正交試驗，設計表見表1。

1.4 檢測指標及方法

發酵液中可溶性肽含量采用Folin-酚法進行測定[13]。

2 結果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌發酵試驗結果

2.1.1 枯草芽孢桿菌單因素試驗結果

2.1.1.1 料水比單因素試驗結果

考察料水比單因素對發酵效果的影響是因為水分對微生物的生長也起到了關鍵的作用，將料水比設定為1:1、1:3、1:5、1:7、1:10，發酵液中菌液接種量為10%，發酵溫度37℃，放入恒溫培養中發酵1 d。采用福林酚法測定發酵液中可溶性肽的含量。實驗結果如圖1。

從圖1中可知，1:5和1:10的料水比得到可溶性肽含量值較高，綜合考慮，選擇料水比為1:5.

2.1.1.2 碳源接種量單因素試驗結果

將發酵料水比設定為1:5，發酵液中菌液接種量為10%，發酵溫度37℃，放入恒溫培養中發酵1 d，將碳源添加量設定為2%、5%、7%、10%、12%，發酵結束后測定發酵液中可溶性肽含量，結果如下圖2所示。

從圖2中可知，添加10%和12%的碳源的時候可溶性肽含量幾乎相同，考慮到節約成本，試驗采用10%的碳源添加量。

2.1.1.3 菌液接種量單因素試驗結果

菌液接種量是發酵實驗中一個重要的因素，接種過多或過少都會對發酵液中的可溶性肽含量有影響。因此為了確定合適的菌液接種量，本次試驗將接種量定為5%、7%、10%、12%、15%進行發酵，結果如圖3。

圖1 料水比對發酵液中可溶性肽含量的影響Fig.1 Effect of feed water ratio on soluble peptide content in fermentation broth

圖2 碳源添加量對發酵液中可溶性肽含量的影響Fig.2 Effect of carbon addition on soluble peptide content in fermentation broth

圖3 接種量對發酵液中可溶性肽含量的影響Fig.3 Effect of inoculum size on solublepeptide content in fermentation broth

圖4 培養時間對發酵液中可溶性肽含量的影響Fig.4 Effect of culture time on soluble peptide content in fermentation broth

從圖3中可知，可溶性肽的含量先是隨著接種量的增加而上升的，當接種量達到12%時出現峰值，含量最高；5%的時候最低，分析其原因有可能是因為接種量太少時沒有充分與底物結合，所以發酵效果較次，接種量太多導致菌種間生長競爭，生長過快導致營養缺乏，所以發酵液中可溶性肽含量也不高；故采用12%的接種量。

2.1.1.4 發酵時間單因素試驗結果

為了探討最佳的發酵時間，試驗將發酵培養時間設定為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d進行發酵，結果如圖4所示。

從圖4中可以看出發酵前4 d里發酵液中可溶性肽含量的變化不是很大，第5 d有較為明顯的下降，考慮到實際的需求，發酵時間越短越好，因此確定發酵時間為1 d。

2.1.2 枯草芽孢桿菌工藝優化試驗結果

2.1.2.1 正交試驗設計及結果

由表2極差R分析結果可知，發酵液中可溶性肽含量的影響因素主次順序為：料水比＞接種量＞碳源添加量，也就是料水比是影響枯草芽孢桿菌發酵魷魚內臟發酵液中可溶性肽含量的重要因素，其次是接種量和碳源添加量。最優組合為A2，B2，C3，即發酵的最佳條件：料水比為1:5，碳源添加量為10%，菌液接種量為12%，發酵時間為1 d。

2.2 討論

通過單因素試驗和正交試驗可以看出，枯草芽孢桿菌發酵魷魚內臟試驗過程中，單因素試驗結果和正交試驗結果基本一致。對枯草芽孢桿菌單因素和正交試驗結果的進一步分析，發現發酵產物可溶性肽含量可達到20.87 g/L。這主要是因為枯草芽孢桿菌能夠產生一系列酶系，產生的酶能夠將魷魚內臟里面的一些成分降解，使得一些不可溶和難以吸收消化的大分子物質降解為可吸收的小分子的多肽類，小分子蛋白類；從而使得發酵液中的可溶性肽含量會有所增加。已有的研究表明枯草芽孢桿菌可提高奧尼羅非魚[14]、凡納濱對蝦[15]和印度明對蝦的消化酶活性和飼料轉化率[16]。與此同時，其代謝過程中還能合成B族維生素及VE、VK等營養素，還能促進Ca、P的吸收，提高動物的生長性能[17]。

3 結論

將微生物發酵技術應用在處理海產品下腳料中，用單因素和正交試驗對發酵工藝進行優化，根據正交試驗分析得到了各因素對枯草芽孢桿菌發酵魷魚內臟下腳料的影響，獲得了最佳發酵工藝條件：菌液接種量為12%，料水比為1:5，碳源添加量為10%，發酵時間為1 d。枯草芽孢桿菌在此組合下發酵魷魚內臟，發酵液中可溶性肽含量達到20.871 8 g/L。由此可知，利用微生物對海產品加工過程中剩下的廢料進行回收處理，不僅可以對其加工成具有經濟價值的生物制品，同時也對環境起到一定的保護作用，符合現在的綠色環保發展理念；同時也豐富了微生物的研究內容，對這一項技術所能應用的領域及對象得到擴大并提供相應的資料文獻用以參考。

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