FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義

劉 靜，周炳娟，馬秋雙，陳 紅，張金庫

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的健康和生命。目前，有關(guān)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制、生物學(xué)行為、預(yù)后指標(biāo)及靶向治療方法等方面的研究是醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。本研究采用免疫組織化學(xué)的方法檢測叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1(FOXM1)、Polo樣激酶1(PLK1)、缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)及果蠅Zeste基因增強(qiáng)子人類同源物2(EZH2)在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)情況及其與乳腺癌臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系，以期為乳腺癌的臨床治療和預(yù)后判斷提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2005-01至2014-10河北省保定市第一中心醫(yī)院病理科確診的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌石蠟標(biāo)本，選取有完整臨床病理資料的803例，癌旁乳腺組織(距腫瘤邊緣5 cm的乳腺組織) 作為對照。患者均為女性，年齡24～79歲，平均(51.0±1.8)歲。組織學(xué)分級Ⅰ級164例，Ⅱ級361例，Ⅲ級278例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的348例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的455例；Ⅰ～Ⅱ期678例，Ⅲ～Ⅳ期125例。乳腺癌患者術(shù)前均未行放療、化療及內(nèi)分泌治療。

1.2 免疫組化 兔抗人FOXM1多克隆抗體、兔抗人PLK1單克隆抗體、HIF-1α多克隆抗體購自美國Abcam公司、兔抗人 EZH2 單克隆抗體購自美國CST公司，采用MaxVision兩步法染色，具體操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。PBS代替一抗設(shè)為陰性對照；以已知FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2陽性的胃癌組織設(shè)為陽性對照。

1.3 染色結(jié)果判定 Fox1M1、PLK1和HIF-1α蛋白陽性染色主要為細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒；EZH2蛋白陽性染色主要為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，少量胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(× 400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù) 200個(gè)細(xì)胞，共計(jì)1000個(gè)，觀察染色強(qiáng)度并計(jì)算每張切片陽性細(xì)胞百分率[1-4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用IBM SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，多個(gè)樣本率的兩兩比較采用卡方分割法，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2蛋白的表達(dá)情況 FOXM1、PLK1、HIF-1α和EZH2蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組中的陽性表達(dá)率顯著高于其在癌旁乳腺組織中的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1，表1)。

圖1 FOXM1、PLK1、HIF-1α、EZH2在乳腺癌組織中的表達(dá)(IHC×200) A. FOXM1；B. PLK1；C. HIF-1α；D. EZH2 表1 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者FOXM1、PLK1、HIF-1α和EZH2蛋白在各組中的表達(dá) (n；%)

2.2 FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2蛋白與乳腺癌臨床病理特征間的關(guān)系 FOXM1、PLK1、HIF-1α和EZH2蛋白的表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)，而與患者年齡、是否絕經(jīng)及腫瘤大小無關(guān)。PLK1、HIF-1α和EZH2蛋白的表達(dá)與ER負(fù)相關(guān)，F(xiàn)OXM1和EZH2蛋白的表達(dá)與HER-2正相關(guān)(P<0.01，表2)。

2.3 FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中表達(dá)的相關(guān)性分析 FOXM1、PLK1、HIF-1α和EZH2蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(表3)。

表2 FOXM1、PLK1、HIF-1α和EZH2與乳腺癌臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系 (n；%)

注：與組織學(xué)Ⅰ級比較，①P<0.001；與組織學(xué)Ⅱ級比較，②P<0.001。與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，③P<0.001。與Ⅲ～Ⅳ期比較， ④P<0.001。與ER陰性比較，⑤P<0.001。與HER-2陰性比較，⑥P<0.001

表3 乳腺癌中FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

FOXM1是叉頭框蛋白家族中的一員，其異常表達(dá)能夠促增殖，抗凋亡、參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等[5，6]。FOXM1在乳腺癌中顯著高表達(dá)，而且能夠與ERα相互作用，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖[7]。同時(shí)，作為HER-2下游的靶基因，F(xiàn)OXM1的表達(dá)受到HER-2調(diào)節(jié)從而發(fā)揮促進(jìn)乳腺腫瘤形成的作用[8]。PLK1是polo-like激酶家族的重要成員，控制著有絲分裂的多個(gè)階段[9]。研究發(fā)現(xiàn)，PLK1在三陰性乳腺癌中表達(dá)水平更高，而且PLK1與ERα的表達(dá)相關(guān)，因此認(rèn)為PLK1可能是TNBC潛在的治療靶點(diǎn)[2,10]。HIF-1α是廣泛存在于多種細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，能夠促進(jìn)乳腺原發(fā)腫瘤的生長、誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞表型(BCSC表型)，通過增強(qiáng)缺氧乳腺癌細(xì)胞的能動(dòng)性，使癌細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的能力。HIF-1α高表達(dá)與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的無病生存期及總生存期較短有關(guān)，并與乳腺癌高復(fù)發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率及高死亡率有關(guān)[11]。EZH2基因定位于人染色體 7q35 的位置上，為表觀遺傳調(diào)控因子多梳抑制復(fù)合體 2 (polycomb repressivecomplex 2, PRC2) 的催化亞基，可通過其組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性對組蛋白的第27位的賴氨酸進(jìn)行甲基化，抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，參與多種生理或病理過程。有學(xué)者證實(shí)，從正常乳腺組織、不典型增生、導(dǎo)管原位癌至浸潤性導(dǎo)管癌，EZH2的表達(dá)逐漸增加，而且EZH2高表達(dá)與乳腺癌的浸潤及高增殖活性密切相關(guān)[12,13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁乳腺組織相比，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2蛋白的陽性表達(dá)率顯著升高，而且隨著組織學(xué)分級增加，F(xiàn)OXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2的表達(dá)也逐漸升高。同時(shí)，F(xiàn)OXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期Ⅲ-Ⅳ期組乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期Ⅰ～Ⅱ期組。研究結(jié)果進(jìn)一步提示FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2可能參與了乳腺癌的發(fā)生，而且與乳腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移的能力有關(guān)，可能成為乳腺癌預(yù)后評估重要的指標(biāo)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PLK1、HIF-1α及EZH2與ER表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與HER-2呈正相關(guān)關(guān)系，提示三種蛋白過表達(dá)可能在ER陰性乳腺癌的癌變過程中發(fā)揮更重要的作用。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及復(fù)雜的、相互作用機(jī)制。FOXM1通過周期性上調(diào)CCNB1和PLK1在內(nèi)的一組基因的表達(dá)控制著有絲分裂的啟動(dòng)，而PLK1通過直接的磷酸化作用，調(diào)節(jié)FOXM1的轉(zhuǎn)錄，并增強(qiáng)其活性，二者參與形成一個(gè)激酶誘導(dǎo)的正反饋鏈[14,15]。缺氧條件下，HIF-1α一方面通過選擇性抑制SUZ12和EED使PRC2失活；另一方面增強(qiáng)了EZH2 與FOXM1的聯(lián)合作用，使MMPs表達(dá)增加，促進(jìn)了三陰性乳腺癌的浸潤[16]。同時(shí)，EZH2 是 miRNA-101的直接靶分子，在前列腺癌細(xì)胞中，HIF-1α通過抑制miRNA-101促進(jìn)EZH2蛋白的表達(dá)。VEGF/ VEGFR2信號(hào)通路可通過影響E2F、miR-101、HIF-1α等分子，調(diào)節(jié)EZH2表達(dá)。VEGF促進(jìn)HIF1α活性，增加肺癌中EZH2表達(dá)水平，降低肺癌中VEGF水平，能夠抑制EZH2表達(dá)，影響肺癌的生物學(xué)進(jìn)程[17-19]。本研究顯示，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2的表達(dá)具有正相關(guān)關(guān)系，提示乳腺腫瘤形成過程中四種蛋白可能發(fā)揮了協(xié)同作用，促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移，可能成為評估乳腺癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。同時(shí)，深入研究FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2上下游分子及靶基因的功能，將為探索靶向治療策略提供理論支持。

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